免疫抑制性TGF-β信号转换器的制造方法
【专利说明】
[0001 ]本发明要求2013年4月17日提交的美国临时专利申请第61 /812，917号的优先权， 其通过引用全文纳入本文。
[0002] 关于联邦资助的研究或开发的声明
[0003] 本发明是在美国国防部基金第W81XWH-11-1-0625号的政府支持下完成的。政府对 本发明拥有某些权利。
技术领域
[0004] 本发明的实施方式至少涵盖以下领域:免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学， 包括癌症医学。
[0005] 背景
[0006] 转化生长因子i3(TGFi3)已被证明在调控免疫应答方面起重要作用，主要是通过其 对于免疫系统细胞的抑制功能。TGF0是抗原特异性T细胞增殖的抑制因子，其至少通过降低 细胞周期速率发挥功能，与诱导凋亡相反。具体而言，TGFM乍用于细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 以特异性抑制至少五种溶细胞性基因产物的表达:穿孔蛋白、粒酶A、粒酶B、Fas配体和干扰 素 y，其对于CTL介导的肿瘤细胞毒性而言至关重要(Thomas和Massagu6,2005)。
[0007] 概述
[0008] 本发明的实施方式包括用于癌症治疗的方法和组合物。在具体的实施方式中，描 述了涉及癌症的细胞疗法的方法和组合物。虽然具体的实施方式可用于任何癌症，但在具 体实施方式中，这些方法和组合物对于分泌TGF0或位于释放TGF0的肿瘤微环境(包括肿瘤 间质）中的癌症特别有效。适用于使用本发明公开的组合物和方法进行治疗的示例性癌症 包括但不限于:前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、食道癌、肝癌、肾癌、 睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、胆囊癌、甲状腺癌、肛门癌、子宫内膜癌、膀胱癌、脑下垂体癌、白血 病、淋巴瘤、胃癌和脾癌。
[0009] 本发明的各方面利用经修饰的细胞来表达一种或多种非天然分子，这些分子使细 胞有效地对抗分泌TGF0的癌症。在具体的实施方式中，这些细胞可用于过继细胞疗法。在具 体的方面中，这些细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、细胞毒性T淋巴细胞、抗原特异性T细胞 (包括肿瘤或病原体(如病毒或细菌)特异性T细胞）、具有αβΤ细胞受体(TCR)的T细胞、包含 至少一种嵌合抗原受体的Τ细胞，等。细胞可经遗传工程改造以在TGF0存在时发挥作用，且 还可具有或不具有其他非天然产生的遗传修饰。除嵌合TGF0受体外，这些细胞还可表达其 他非天然分子。在具体的实施方式中，这些非天然分子是细胞表面受体。这些分子可以是特 异性针对例如肿瘤细胞表面分子或ai3TCR的嵌合抗原受体(CAR)。在某些方面中，细胞可使 用一种或多种嵌合抗原受体和嵌合TGF0受体。
[0010]在本发明的各实施方式中，本发明的细胞通过使用嵌合TGF0受体将来自TGF0的正 常抑制信号转化为对T细胞的激活刺激，该嵌合TGF0受体使用细胞表面上的TGF0胞外受体， 其连接能够产生激活信号的另一实体的胞内结构域(endodomain)。在【具体实施方式】中，与 缺少这类嵌合受体的细胞相比，使用这类嵌合受体修饰的T细胞具有提高的效力。本发明的
【具体实施方式】使用以下嵌合TGFi3受体，其表达与来自另一分子的胞内结构域相连的TGFi3 RII的胞外结构域(exodomain)。在【具体实施方式】中，该胞外结构域和胞内结构域通过跨膜 结构域相连，且在某些实施方式中该跨膜结构域是天然产生的针对所选胞内结构域的跨膜 结构域。虽然TGFI3的受体可以是TGFI3受体l、TGFf3受体2或TGFI3受体3中任一种的部分或全 部，但在【具体实施方式】中其包含该受体的TGFI3受体2同种型。在【具体实施方式】中，该胞内结 构域包含示例性toll样受体(TLR)4的胞内结构域，但也可使用其他，如TLR1、TLR2、TLR3、 TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、4-1BB、0X40、0)3ζ、CD40、CD27，或其组合。在具体 实施方式中，该嵌合细胞因子受体是经标记的，例如使用GFP、mOrange、蓝色焚光蛋白等标 记。
[0011] 在本发明的某些方面中，包含嵌合TGF0受体的细胞还包含嵌合抗原受体。该嵌合 抗原受体(CAR)可以是任何类型，但在【具体实施方式】中该CAR靶向也分泌TGF0分子的癌症。 示例性CAR包括至少特异性针对以下任意一种或多种的CAR:EphA2、HER2、⑶2、磷脂酰肌醇 蛋白聚糖_3、5丁4、8!19、€^ 6整联蛋白、8细胞成熟抗原(8〇嫩)87-!13、87-!16、〇厶1父、〇厶9、0)19、 CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD 123、CD 138、CD 171、 CEA、CSPG4、EGFR、EGFRv III、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿 AchR、叶酸受体 a、GD2、GD3、HLA-AIMAGEAl、HLA-A2、ILllRa、IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、]?11。1、]\111。16、％厶1、疆620配体、阶450-1、？1^1^、？5〇八、？5(：1、？5]\^、1?01?1、 Sp 17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF 受体、和/或其他在肿 瘤的胞外基质中存在的示例性抗原(如纤连蛋白的癌胚变体、生腱蛋白或肿瘤的坏死区）和 通过例如肿瘤的遗传分析和或差异表达研究鉴定的其他肿瘤相关抗原或可用突变，或其组 合。本发明的细胞可具有超过一种CAR，且CAR可具有特异性针对不同抗原的超过一种scFv。
[0012] 在本发明的某些方面中，包含(如表达)嵌合TGFi3受体的细胞还包含(如表达)抗原 特异性受体。该抗原可以是肿瘤抗原或病原体抗原，包括例如病毒或细菌抗原。
[0013] 示例性的肿瘤抗原至少包括下述：肠癌癌胚抗原（CEA);卵巢癌CA-125;乳腺癌 MUC-1或上皮肿瘤抗原（ETA)或CA15-3;恶性黑色素瘤的酪氨酸酶或黑色素瘤相关抗原 (MAGE);和各种类型肿瘤的ras、p53的异常产物;肝细胞瘤、卵巢癌或睾丸癌的α胎甲球蛋 白；睾丸癌男性患者的hCG的β亚基;前列腺癌的前列腺特异抗原;多发性骨髓瘤或一些淋巴 瘤中的β2微球蛋白；结肠直肠癌、胆管癌和胰腺癌的CA19-9;肺癌和前列腺癌的嗜铬粒蛋白 A;黑素瘤、软组织肉瘤和乳腺癌、结肠癌和肺癌的ΤΑ9 0。本领域已知肿瘤抗原的例子，例如 Cheever等2009中所述，其通过引用全文纳入本文。肿瘤抗原的具体示例至少包括例如CEA、 gpl〇〇、间皮素、TRPl、CD40、EGFP、Her2、TCRa、trp2、MUCl、cdr2、ras、GITR、WTl、MUCl、LMP2、 HPV E6E7、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、p53非突变体、NY-ES0-1、PSMA、⑶2、Melan A/ MARTl、Ras突变体、gp 100、p53突变体、蛋白酶3(PRl)、bcr-abl、酪氨酸酶、生存素、PSA、 hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2ETS融合基因）、NA17、PAX3、ALK、雄激素 受体、细胞周期蛋白B1、多聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、⑶3、海藻糖GM1、间皮素、PSCA、MAGE Al、sLe(a)、CYPlBl、PLACl、GM3、B0RIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-l、RGS5、SART3、STn、碳 酸酐酶 IX、PAX5、0Y-TESl、精液蛋白17、LCK、HMffMAA、AKAP-4、SSX2、XAGEl、B7H3、豆荚蛋白、 Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-l、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2和Fos相关抗原l。
[0014] 可由抗原受体T细胞针对的特定病毒包括:EBV、CMV、腺病毒、BK病毒、HHV6、RSV、流 感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠状病毒、LCMV、聰腺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、细小病 毒B、轮状病毒、西尼罗河病毒、JC、HHV7，及其组合。在一些情况中，该病毒是EBV且该抗原选 自EBNA1、LMP2和BZLF1;该病毒可以是CMV且该抗原可选自IE1和pp65;该病毒可以是Adv且 该抗原可选自六邻体和五邻体;该病毒可以是BK病毒且该抗原可选自LT和VP-1;该病毒可 以是HHV6且该抗原可选自U14、U11、U71、U54和U90;该病毒可以是RSV且该抗原可选自N和F; 该病毒可以是流感病毒且该抗原可选自MP1和NP1。
[0015] 在本发明的实施方式中，存在T细胞上新型免疫抑制性信号转换器的转基因表达。 该信号转换器通过使用嵌合TGF0受体将免疫效应细胞上TGF0的正常抑制作用转变为针对 细胞的刺激信号，该嵌合TGF0受体具有TGFI3胞外结构域，其与不来自TGF0受体的胞内结构 域相连且提供激活信号。
[0016] 在本发明的实施方式中，存在一种包含编码嵌合TGF0受体的核苷酸序列的多核苷 酸，该受体包含TGFI3受体的胞外结构域和非TGFI3受体胞内结构域。在【具体实施方式】中，该胞 内结构域包含免疫刺激蛋白的胞内结构域或其功能片段，该胞内结构域或其功能片段来自 to 11 样受体（TLR) 1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、CD28、41BB、41BB、0X40、 CD40、CD27,或其组合。在具体情况中，该胞内结构域来自toll样受体(TLR)4。在具体实施方 式中，该多核苷酸还包含编码嵌合抗原受体(CAR)或αβΤ细胞受体(TCR)的多核苷酸序列。在 一些实施方式中，嵌合TGF0受体的表达和CAR和/或αβτα?的表达在相同或不同的一个或多 个调控元件的控制下。
[0017] 在其中使用一种或多种多核苷酸的实施方式中，该多核苷酸可进一步限定为表达 构建体或载体，且该载体可以是病毒载体(如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或 腺相关病毒载体)或非病毒载体，如质粒或RNA，包括mRNA。
[0018] 在某些实施方式中，提供了包含本发明所述多核苷酸的一种或多种细胞。这类细 胞可以是例如T细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、抗原特异性T细胞，或包含α CTCR的Τ细胞，或CTL。在具体的实施方式中，这些抗原特异性Τ细胞被进一步限定为肿瘤特 异性T细胞或病原体特异性T细胞。在具体的方面中，该TGF0受体包含部分或全部TGF0受体 II。在一些情况中，这些抗原特异性T细胞的抗原特异性是天然的，而在某些情况中，这些抗 原特异性T细胞的抗原特异性是重组生成的。在具体的情况中，该细胞是抗原特异性T细胞， 和/或包含aCTCR，其可以是对T细胞而言初始的(native)或是经工程改造的分子。在具体的 方面中，该抗原特异性T细胞被进一步限定为肿瘤特异性T细胞或病原体特异性T细胞。在一 些情况中，该抗原特异性T细胞的抗原特异性是天然的，而在某些情况中，该抗原特异性T细 胞的抗原特异性是重组生成的。在一些情况中，细胞上的aCTCR是天然的，而在其他方面中， 细胞上的aOTCR是重组生成的；该αβΤΟ?可选自例如文库。
[0019] 在本发明的实施方式中，存在一种或多种细胞，其包含编码嵌合TGF0受体的第一 多核苷酸（该嵌合TGF0受体包含TGF0受体的胞外结构域和非TGF0受体胞内结构域）以及编 码CAR和/或αβτα?的第二多核苷酸。在一些情况中，第一和第二表达构建体是相同或不同的 分子。该抗原特异性Τ细胞可以是肿瘤特异性Τ细胞受体或病原体特异性Τ细胞受体。该CAR 可特异性针对选自下组的抗原：？304、册1?2、0019、0020、0022、1〇链或轻链、〇030、0)33、 〇)123、〇)38、1?01?^外83/446卩1?46卩1^1114?1^2、卩八？、癌胚抗原46?2』6?40、间皮素、 TAG72、PSMA、NKG2D 配体、B7-H6、IL-13 受体 a2、IL-ll 受体 Ra、MUCl、MUC16、CA9、GD2、ffl)3、 HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ES0-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44 v7/8、8H9、NCAM、VEGF 受体、5T4、胎牛AchR、NKG2D 配体、CD44 v6、TEM1、TEM8，或其组 合。
[0020] 在一些实施方式中，本发明提供了一种或多种细胞，其限定为：1)是抗原特异性T 细胞，和/或包含CAR的细胞，和/或包含αβΤ细胞受体的细胞；以及2)包含嵌合TGFi3受体，该 受体包含TGFI3受体的胞外结构域和非TGFI3受体胞内结构域。在【具体实施方式】中，该细胞对 于所述细胞的接受者(recipient)而言是自体的。在一些情况中，该细胞对于所述细胞的接 受者而言是同种异体的。
[0021] 在本发明的实施方式中，提供了一种治疗和/或预防个体中癌症的方法，包括以下 步骤：向该个体递送治疗有效量的本发明所述多种细胞，该个体患有癌症，该癌症具有分泌 TG邱的细胞和/或具有产生TGF0的微环境。虽然在一些情况中该癌症可以是任意类型，但在 具体情况中，该癌症是前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、脑癌、结肠癌、食道癌、肝 癌、肾癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、胆囊癌、甲状腺癌、肛门癌、子宫内膜癌、膀胱癌、脑下垂 体癌、白血病、淋巴瘤、胃癌、脾癌或骨髓瘤。在具体的实施方式中，这些细胞经静脉内、腹膜 内、瘤内、鞘内和/或跨直肠递送。在一些实施方式中，细胞暴露于TGF0保护或增强该细胞的 抗肿瘤活性。在具体方面中，向该个体提供另一种癌症治疗，例如手术、化疗、免疫治疗、激 素治疗、放疗或其组合。在某些实施方式中，这些细胞对于所述个体而言是同种异体或自体 的。在一些实施方式中，本发明的方法还包括从该个体或另一个体获得外周血单核细胞 (PBMC)的步骤。在【具体实施方式】中，该方法包括以下步骤:从这些PBMC获得T细胞并修饰这 些T细胞以包含含有编码嵌合TGF0受体的核苷酸序列的多核苷酸，该受体包含TGF0受体的 胞外结构域和非TGFI3受体胞内结构域。在本发明的实施方式中，超过一次地向该个体提供 细胞。在具体的情况中，当超过一次提供细胞且这些细胞包含特异性针对特定肿瘤抗原的 CAR时，一次或多次后续递送后这些细胞包含特异性针对不同肿瘤抗原的CAR。
[0022] 在本发明的一个实施方式中，存在一种将T细胞抑制性细胞因子信号转化为T细胞 刺激性信号的方法，包括以下步骤:将抑制性细胞因子暴露于T细胞上的受体，所述受体具 有胞外结构域和不与该胞外结构域天然连接的胞内结构域，该胞外结构域能够结合抑制性 细胞因子且该胞内结构域向该T细胞提供刺激性信号，该胞外结构域和胞内结构域配对为 同源二聚体。在【具体实施方式】中，该细胞因子是TGF0或VEGF。
[0023] 在本发明的一个实施方式中，存在一种将T细胞抑制性细胞因子信号转化为T细胞 刺激性信号的方法，包括以下步骤:将抑制性细胞因子暴露于T细胞上的受体，所述受体具 有胞外结构域和不与该胞外结构域天然连接的胞内结构域，该胞外结构域能够结合抑制性 细胞因子且该胞内结构域向该T细胞提供刺激性信号，该抑制性细胞因子不是IL4或IL7或 上述两者。在【具体实施方式】中，该细胞因子是TGF0或VEGF。
[0024]本发明的实施方式在存在分泌抑制剂TGF0的癌细胞的情况下改善了体内过继转 移治疗的细胞活性。
[0025] 在本发明的一个实施方式中，存在包含本文所述多核苷酸或多肽和/或一种或多 种本文所述细胞的试剂盒。
[0026] 前述内容描述了本
【发明内容】
的特征和技术优点，使得能够更好地理解以下的详细 说明。以下描述的本
【发明内容】
的附加特征和优点构成本发明要求的主题。本领域的技术人 员应理解，所揭示的观念和【具体实施方式】可以方便地被用作改进或设计实现本发明的同样 目的的其他结构的基础。本领域的技术人员还应认识到这种等价结构没有偏离所附权利要 求书中提出的本发明的精神和范围。被认为是本发明的特性的新特征，对于其构建和方法 的操作，还有其他对象和优点等，可以结合以下详细的说明和附图一起，得到更好的理解。 但应理解，各附图仅仅是为了示意和说明，并不旨在对本发明进行限定。
[0027]附图简要说明
[0028]为了更完整地理解本发明，下面结合附图提供以下说明，其中：
[0029] 图1显示装备T细胞以耐受抑制性肿瘤微环境的示例性实施方式。
[0030] 图2提供对照DNRII、RIID2和RIID4的示例性逆转录病毒载体图谱。
[0031] 图3显示DNRII、RIID2和RIID4转基因 T细胞的生成。
[0032]图 4A-4B 显示 DNRII、RIID2 和 RIID4 与 CAR-PSCA · 2G 共表达的测定。
[0033] 图5显示RIID2和RIID4是否保护暴露于TGF邱勺CAR修饰的T细胞。
[0034] 图