去除污染物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于纯化载脂蛋白的方法，特别是用于从含有载脂蛋白A-I (ApoA-I)的溶液去除病毒病原体的方法，并涉及提供一种Apo A-Ι制备物。
【背景技术】
[0002] 载脂蛋白是可溶性脂蛋白复合体中的主要蛋白质组分，载脂蛋白A-I(ApoA-I)为 高密度脂蛋白（HDL)颗粒的主要蛋白质组分。
[0003] 载脂蛋白的A、C和E家族由共同的祖先基因进化而来，它们在结构上是相似的。这 些蛋白质分子一般含有一系列22-氨基酸串联重复，其常常被脯氨酸残基分隔开。重复的 22-氨基酸节段形成两亲性的α-螺旋，其能够既与脂质结合又与水表面结合。在人Apo A-I (243个氨基酸;28.1kDa)的情况下，有八个22聚体和两个11聚体的两亲性螺旋(Lund-Katz& Phillips ,2010, Subcell Biochem. 51,183-227)。载脂蛋白的两亲性的α-螺旋在稳定脂蛋 白中起着关键性的作用。它们通过定向载脂蛋白来做到这一点，使得主要疏水性的螺旋面 能够与复合体中的疏水性脂质发生相互作用，而载脂蛋白的主要亲水性的相对面与周围含 水环境发生相互作用。但是，当这些蛋白质与脂质组分分开时，疏水性氨基酸残基暴露于含 水环境可使它们变得难以处理。特别是螺旋的疏水面具有自缔合的倾向，其导致聚集体 形成和在一些条件下发生沉淀。例如，据估计，当被存储于pH 7.4的50mM磷酸盐缓冲液中 时，lmg/mL含有Apo A-I Mi lano的溶液含有80 %的聚集形式的蛋白质（Suurkuusk&Hal Ι?η， 2002, Spectroscopy 16,199-206)〇
[0004] Apo A-I由肝脏和小肠合成并负责HDL在血液中的生理功能;通过被称为"反向胆 固醇运输"（RCT)的机制从外周组织去除胆固醇，将其运载回肝脏或其它脂蛋白。结果，HDL 颗粒以一系列尺寸存在于血浆中，并由于这些RCT脂质运输活性而不断重构。因此，HDL颗粒 的特征在于高密度(>l.〇63g/ml)并且尺寸范围为大约5至20nm(斯托克斯直径）。根据流行 病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉心脏疾病(CHD)的发展之间的明显的 相关性已被多次证实。因此，HDL中的Apo A-Ι被认为具有抗炎功能并抑制CHD的发生和发 展。此外，Apo A-Ι已经显示出降低血液中低密度脂蛋白（LDL)水平和已知与脂多糖或内毒 素结合，从而在HDL的抗内毒素功能中具有主要作用。HDL和作为其主要蛋白质组成的Apo A-I的"保护性"的作用已在多项研究中被证实。Apo A-I的高血浆水平与CHD和冠状动脉病 变存在的降低的风险有关。因此，Apo A-Ι有希望应用于像重构的HDL的药物，其用于在急性 冠脉综合征、动脉粥样硬化治疗、抗炎治疗、抗毒素治疗、肝靶向药物等中的应用。
[0005] 通常使用生物学原料制造重组或血浆来源的生物学药物，所述生物学原料被固有 地污染有诸如病毒的病原体。此外，一些制造方法由于其性质容易受到来自外部来源的病 原体污染。因此，需要生物学药物的制造商向他们的制造方法中引入足够的病毒清除步骤， 以确保他们的产品不含污染物。
[0006] 用重组DNA在细胞培养物、转基因动物或转基因植物中生产生物技术产品（通常为 蛋白质或DNA)。生产中使用的常见细胞包括中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、大肠杆菌细菌和酵 母。通常以分批模式实施基于细胞的生产系统，然而也在使用少量灌注系统。主要以基于 CHO的8，000-25，000L规模的发酵器在1，000-100，000L的规模进行最终商业规模的发酵。
[0007] 现在，大量收集人血浆(例如，据已估计，在2010年全世界收集了 3千万升的血浆） 并将其加工成各级分;这些级分中的一些级分含有载脂蛋白，Apo A-Ι。这样的血浆级分的 实例包括科恩上清I，科恩级分Π +ΙΙΙ和科恩级分IV(例如科恩级分IV-1)或其变化(例如为 Kistler/Nitschmann级分IV)。因为血液和血浆潜在地含有输血传播的病原体，当血液来源 的或血浆来源的组分被用作药物或用作治疗递送的载体时，这样的病原体、特别是病毒必 须被去除或灭活。但是，即使这些组分被高度纯化，病毒通常不容易被去除并且可能仍然存 在于血浆来源的组分中。特别受到关注的尤其是小的无包膜病毒，诸如尺寸为大约27-32nm 的小核糖核酸病毒科(例如甲型肝炎病毒)和尺寸为大约18_26nm的细小病毒。这是由于它 们的小尺寸和它们的高物理化学稳定性。因此，存在开发使得血浆来源的蛋白质药物的病 毒被有效去除或灭活的方法的持续需要。
[0008] 常见的病毒灭活技术包括物理方法诸如经典的巴氏灭菌操作(60°c加热10小时）， 短波长紫外光照射或γ射线照射和化学方法诸如溶剂去污剂或低pH温育。病毒去除技术包 括尺寸排阻方法诸如病毒过滤，其也常常被称为纳米过滤。这些病毒过滤方法已被证明是 用于从蛋白质溶液中去除病毒的有效方法。
[0009] 病毒过滤具有用于从蛋白质溶液中去除病毒的温和方法的益处，并且通常允许高 的蛋白质回收水平并完全保留蛋白质的生物学活性。最佳的病毒过滤器必须使得容量、处 理量(throughput)和选择性最大化。病毒过滤器的容量是恒压过滤期间在通量下降到不可 接受的低值之前每m 2过滤器的表面积能够处理的滤液的总体积。处理量是指进料可被过滤 的速度(最大可持续透过通量）。选择性是指产生高的产品回收和高的病毒颗粒保留的能 力。这些过滤器必须能够以可接受的滤液通量处理整个批量的进料，拒绝病毒颗粒，并使蛋 白质通过最大化。病毒过滤期间的结垢通常受蛋白质聚集体、DNA、部分变性的产物或其他 碎片控制。
[0010]过滤器制造商通常给市售过滤器指定像标称或平均的孔径等级的术语，其通常表 示满足某种颗粒或微生物保留标准，而不是表示实际孔的几何尺寸。
[0011]对于病毒清除，通过过滤膜进行过滤，所述过滤膜具有小于待去除的病毒的有效 直径的标称孔径。只有少量异常大的孔(300kDa或更大的标称截留分子量，NMWC0)的存在将 允许过量病毒泄漏。因此，必须这样制造病毒过滤器以便消除所有宏观缺陷。这通常是通过 使用复合膜实现的，其提供所需的病毒保留和机械稳定性的组合。如以下文献:Manabe.S， Removal of virus through novel membrane filtration method.,Dev. Biol. Stand., (1996)88:81_90;Brandwein H等人，Membrane filtration for virus removal., Dev Biol(Basel) ·，（2000)102:157-63;Aranha-Creado等人，Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter.，Biologicals.(1998)June; 26 (2):167-72 ;Moce-Ll ivina等人， Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions , Journal of Virological Methods ,(2003)April, Vol.l09，Issue l，Pages 99-101中所述，去除病毒的过滤膜通常由诸如再生纤维素，例如 铜铵-再生纤维素或合成聚合物材料如亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)或亲水性聚醚砜(PES) 的材料制成。
[0012] 已被描述的病毒过滤方法包括W096/00237,其涉及通过向溶液加入盐到至少0.2M 水平过滤病毒的方法，所述溶液含有大分子（即蛋白质）。该申请人建议使用呈现高盐析效 应的盐，所述效应是霍夫迈斯特(Hofmeister)序列中高的一端的特性，特别是柠檬酸盐、酒 石酸盐、硫酸盐、乙酸盐或磷酸盐阴离子和钠、钾、铵或钙阳离子。特别优选的是氯化钠，并 且不使用在该序列中低的一端呈现低盐析效应的盐(例如GuHCl)。
[0013] 与W096/00237-致，Kim等人（Biotechnology&Bioprocess Engineering，2011， 16,785-792)描述了在氯化钠的存在下（25〇111]\1他(：1，3〇111]\11^8 4!18从口〇八-1的病毒过 滤。该步骤是在从DEAE-FF柱洗脱之后立刻进彳丁的。然而，Apo A_I聚集的倾向限制了制造， 因为理想情况下需要完成过滤步骤或者是因为Apo A-Ι从柱洗脱或者是因为Apo A-Ι需要 在非常低的蛋白质浓度(例如0.1mg/mL)下在盐的存在下进行存储。这后一种方法的缺点则 是需要过大的过滤体积。病毒过滤器的成本是巨大的。因此，由于例如载脂蛋白聚集或过大 的过滤体积导致过滤器容量的任何减少可能导致商业规模上显著更高的加工成本。
[0014] W003/105989涉及包合物(clathyrate)改性剂(诸如多元醇糖或糖醇（即鹿糖和山 梨糖醇））的用途，并且旨在增加过滤膜表面的疏水性和降低蛋白质的流体动力学半径以及 减少期望被过滤的蛋白质的自缔合倾向。
[0015] US 2003/232969 A1涉及用于通过纳米过滤从像纤维蛋白原（340kDa)的高分子量 蛋白质的溶液去除病毒的方法。
[0016] 像相对较小（28kDa)的Apo A-ι的载脂蛋白应该是容易进行病毒过滤的。但是，如 上文已经描述过的，它们的疏水性质以及它们的令人遗憾的形成聚集体的倾向促进蛋白质 团块在过滤器表面上的形成并且还堵塞过滤器的孔。就过滤器本身而言，这既可以通过孔 的堵塞和/或通过饼或沉淀的形成而发生于膜的上表面上也可以发生在膜的孔结构内。结 垢引起恒压操作下流速的衰减并增加在恒定滤液通量下的操作压力。过滤器结垢的结果 是，可能存在过滤选择性的下降，其导致更低的蛋白质回收和/或更低的病毒保留。此外，过 滤器结垢降低容量和处理量，其导致更长的过滤时间和/或需要增加过滤器面积。另外，对 于维持载脂蛋白的溶解性和防止聚集是最佳的操作条件可能对于确保高的病毒清除并不 是最佳的。特别是可能被用于稳定载脂蛋白的离液物质可改变病原体(例如病毒）的可过滤 性，还可能改变过滤膜。结果，特定浓度的离液物质的存在可能也使得不期望的病毒渗透穿 过过滤膜，从而否定了处理包含载脂蛋白的溶液的步骤的有用性。
[0017] 因此，本发明的目的是提供用于安全去除病毒(特别是小的无包膜病毒诸如细小 病毒科）的过滤方法，其适用于包含载脂蛋白（像Apo A-Ι)的溶液，并且其也适用于产业应 用。
【发明内容】
[0018] 通过一种用于纯化载脂蛋白A-I (Apo A-ι)的方法来广义地实现本发明的目的，所 述方法包括通过具有合适的孔径的过滤器过滤包含Apo A-Ι和盐酸胍(GuHCl)的溶液。
[0019] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于纯化载脂蛋白A-I(Ap〇 A-Ι)的方法，包 括以下步骤:a)提供包含Apo A-Ι和盐酸胍(GuHCl)的溶液；以及b)通过具有15nm至35nm的 孔径范围的过滤器过滤所述溶液。
[0020] 在一个实施方案中，所述方法是用于减少Apo A-Ι的病毒污染。在本发明的一些实 施方案中，所述方法是用于减少Apo A-Ι的病毒污染，其中病毒污染包括细小病毒。在特定 实施方案中，细小病毒是小鼠的细小病毒(MVM)。在本发明的一些实施方案中，所述方法是 用于减少Apo A-Ι的病毒污染，其中病毒污染包括小核糖核酸病毒科病毒。在特定实施方案 中，小核糖核酸病毒科病毒是脑心肌炎病毒(EMCV)或甲型肝炎病毒。
[0021] 在一个优选的实施方案中，所述溶液包含5至30g/L的范围内的Apo A-Ι蛋白浓度， 特别是5至20g/L，例如7至12g/L。
[0022] 在一个优选的实施方案中，所述溶液包含减少或抑制所述Apo A-Ι聚集的GuHCl浓 度。所述溶液可以特别包含1.3至3.2M、特别是1.5至2.0M的范围内的GuHCl浓度。更优选地， 溶液中GuHCl浓度为1.7M。
[0023] 在一个实施方案中，所述溶液的pH在7.1至7.5的范围内，诸如为7.3。
[0024]在一个实施方案中，所述溶液通过以下一个或多个步骤制备：1)将Apo A-Ι沉淀物 悬浮于4.0至4.6M的GuHCl;和/或2)将悬浮液稀释至5至30g//L的范围内的Apo A-Ι蛋白浓 度，和/或稀释至1.3M至3.2M的范围内的GuHCl浓度。
[0025]在一个实施方案中，在步骤b)之后，进行用于病毒灭活的热处理步骤。热处理包括 以下步骤：调整所述溶液的pH在6.6至8.0的范围内；以及随后在55至61°C的温度将所述溶 液加热大约30分钟至大约4小时。
[0026]在一个备选的实施方案中，在步骤a)之前，进行用于病毒灭活的热处理步骤。热处 理可以包括以下步骤:提供pH在6.6至8.0的范围内的包含GuHCl和Apo A-Ι的溶液；以及随 后在55至61°C的温度将所述溶液加热大约30分钟至大约4小时。
[0027]在优选的实施方案中，具有pH在6.6至8.0的范围内的溶液包含2.7M至3.9M的范围 内、或者更优选地为3.5M的GuHCl浓度。
[0028]在本发明的实施方案中，具有pH在6.6至8.0的范围内的溶液的pH优选在7.0-8.0 的范围内。在特定实施方案中，pH为7.3。
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