用于体外培养干细胞的方法和培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织培养领域，更重要的是成体组织特异性干细胞的培养和干细胞用于治疗的用途。
【背景技术】
[0002]成体干细胞可用于产生成体干细胞之组织的治疗性处理。然而，培养成体干细胞通常是非常有挑战性的。该方面中的一个难点是其环境经常可成为分化的原因。这种表型的不稳定性代表了用于在体外维持成体干细胞培养的主要挑战。
[0003]组织工程中的环境因子主要由培养基形成并且在干细胞培养的情况下，这种培养基通常会含有哺乳动物来源的血清。所述血清在定义上是未知因子(如血清蛋白和其他已经被分泌到血液和/或被血液转运的影响性化合物)的来源。非常重要的是在干细胞的治疗性应用中使未知组分的量尽可能的小，因为引入到患者体内的生物材料应当尽可能受控。在此期间已经开发了用于胚胎干细胞的无血清培养基(参见例如Vail ier，L.，2011Meth.Molec.B1l.，690:57-66)。仍未提出用于成体人干细胞系的无血清培养基。
[0004]此外，干细胞培养基应当能够提供所有营养物和干细胞扩增所必须的其他化合物，但它们不含将对干细胞的生长或扩增有害的或者将导致干细胞进一步不明确地分化成特定细胞的化合物。在过去15年中，已经示出Wnt信号转导通路调节胚胎干细胞和多种成体组织干细胞(例如来自于胃肠系统、皮肤和头发以及神经系统的那些)二者的自我更新和细胞命运选择(Clevers，H.和Nusse，R.,2012,Cell 149:1192-1205)。这些数据表明Wnt信号对于培养物中干细胞的自我更新将是有益的并且可以提供在其重新引入患者中之前体外扩增干细胞的途径。最近已经定义了用于数种人和小鼠成体干细胞的培养系统(Huch，M.等，2013,Nature 494:247-250)。这些系统依赖于Wnt通路的激动剂(R-Spondinl)，其通过结合Lgr5受体起作用并且由此通过Wnt蛋白增强了Wnt信号转导通路的激活。对于结肠、胃、肝和人干细胞，内源Wnt信号是不足够的并且需要外源Wnt3a。然而，注意到与经Wnt3a条件化(condit1n)的含血清培养基相比，经纯化的Wnt3a在维持胃样器官方面提供较低的效力(Barker，N.等，2010，Cell Stem Cell 6:25-36)。然而，如上所指出的，在临床应用中，不希望存在血清。
[0005]Wnt蛋白是一组长度为350-400个氨基酸之分泌的经脂质修饰的(棕榈酰化)信号转导蛋白。在信号序列之后，它们携带20-24个半胱氨酸残基的保守模式，其上发生对半胱氨酸残基的棕榈酰化。这些蛋白质激活细胞中的多个通路，所述通路可被归类为经典的和非经典的Wnt通路。通过这些信号转导通路，Wnt蛋白在胚胎发育、细胞分化和细胞极性产生中发挥多种重要作用。人Wnt3a基因是WNT基因家族的成员。其编码示出与小鼠Wnt3A蛋白96%氨基酸同一性的蛋白质，以及与人WNT3蛋白质(另一WNT基因产物)84%氨基酸同一性的蛋白质。Wnt3a基因与WNT14基因(另一个家族成员，在染色体lq42区中)成簇。
[0006]Wnt蛋白是可溶的信号转导分子，其需要连接脂质部分以获得活性，并且由于这个原因是疏水的(Willert，K.等，2003，Nature 423:448-452)。因此，在存在维持其溶解性的去污剂的存在下对其进行纯化。然而，在细胞培养基中稀释之后，特别是在不存在血清的情况下，去污剂的浓度不足以维持Wnt溶解性，然后其迅速失去活性(FuerenC.等，2010，Dev.Dyn.239:184-190)。
[0007]最近，在不存在血清的情况下，人成体干细胞不能被有效地获得和/或维持，因为这导致培养物中Wnt活性不足。可以以数种方式维持干细胞培养物中的高Wnt活性:
[0008]-频繁地补充培养基，这极大地增加了成本并且还干扰了培养，这通常是不期望的；
[0009]-添加血清，血清是未明确限定的产品，其干扰临床应用并且诱导许多干细胞的分化；
[0010]-使用Wnt条件化的培养基(参加定义的实验部分)替代经纯化的Wnt。然而，条件化培养基中的Wnt与血清具有相同的缺点；
[00?1 ]-可能添加稳定Wnt的化合物，例如葡糖胺聚糖。除了极端昂贵之外，也未证明添加葡糖胺聚糖的有益效果。
[0012]因此，有需要开发用于培养成体人干细胞的更明确限定的培养基，其中增强细胞的增殖并抑制细胞的分化。这样的培养基将优选地包含将维持长时间活性的一种或更多种Wnt蛋白，并且这种培养基将需要没有血清或者其他未限定的组分。此类无血清成体人干细胞培养基的可用性还将使得能够进一步使用此类成体干细胞。
【发明内容】
[0013]本发明涉及用于体外培养干细胞的方法，其中将所述细胞保持在包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基中，其中所述脂质的可利用浓度为至少0.lmM。优选地，在所述方法中，所述脂质为脂质体或胶束的形式，更优选地，所述脂质和所述Wnt蛋白缔合成复合物。优选地，这样的脂质体由二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1，-rac-丙三醇)(DMPG)和胆固醇构成，优选DMPC: DMPG:胆固醇的比为10:1:10。
[OOM]在另一个优选的实施方案中，所述Wnt蛋白选自人Wnt蛋白，其中所述蛋白优选Wnt3a。在又一个优选的实施方案中，所述干细胞是成体干细胞，优选肠干细胞，更优选从十二指肠和/或回肠获得的干细胞。还优选的是根据本发明的方法，其中所述干细胞培养物是器官样组织(organoid)培养物。
[0015]本发明还涵盖用于干细胞培养的无血清培养基，其包含Wnt蛋白和脂质，其中所述脂质的可利用浓度为至少0.lmM，优选其中所述脂质是脂质体或胶束的形式。
[0016]本发明的另一方面是用于干细胞治疗的方法，其包括以下步骤:
[0017]a.从对象分离干细胞；
[0018]b.任选地处理所述干细胞，其中所述处理可以选自:分化、去分化、再分化、重编程、引入突变、遗传修饰；
[0019]c.在根据本发明的无血清培养基中培养所述干细胞；
[0020]d.将所述经培养的干细胞引入到有此需要的对象中。
[0021]本发明还包括用于自体成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤:
[0022]a.从对象分离成体干细胞；
[0023]b.在根据本发明的无血清培养基中培养所述成体干细胞；
[0024]c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
[0025]本发明还包括用于自体成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤:
[0026]a).从对象分离成体干细胞；
[0027]b).对所述成体干细胞进行遗传修饰；
[0028]c).在根据本发明的无血清培养基中培养所述经遗传修饰的成体干细胞；
[0029]d).将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
[0030]本发明还包括用于成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤:
[0031]a.从对象的器官分离成体干细胞；
[0032]b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
[0033]c.在根据本发明的无血清培养基中培养所述经遗传修饰的成体干细胞；
[0034]d.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中，
[0035]其中以这样的方式遗传修饰所述成体干细胞使得它们产生用于治疗疾病的治疗性化合物，其中所述疾病与步骤a中得到的所述成体干细胞所来源的器官或器官系统无关或仅部分相关。
[0036]本发明还包括用于成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤:
[0037]a.从对象的器官分离成体干细胞；
[0038]b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
[0039]c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中，
[0040]其中以这样的方式遗传修饰所述成体干细胞使得它们产生用于治疗疾病的治疗性化合物，其中所述疾病与步骤a中得到的所述成体干细胞所来源的器官或器官系统无关或仅部分相关。
[0041]本发明还包括包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基，其用于成体干细胞治疗，其中所述成体干细胞治疗包括:
[0042]a.从对象分离成体干细胞；
[0043]b.在根据本发明的无血清培养基中培养所述成体干细胞；
[0044]c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
[0045]本发明还包括包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基，其用于成体干细胞治疗，其中所述成体干细胞治疗包括:
[0046]a.从对象分离成体干细胞；
[0047]b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
[0048]c.在根据本发明的无血清培养基中培养所述成体干细胞；
[0049]d.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
【附图说明】
[0050]图1:经Wnt3a条件化的培养基，而非经纯化的Wnt3a蛋白支持得到肠干细胞器官样组织。在经Wnt3a条件化的培养基、经纯化的Wnt3a或者经纯化的Wnt3a和血清的存在下，得到人十二指肠和回肠器官样组织培养物。自得到起的第一次传代之后，从器官样组织培养物获取照片。
[0051]图2:在无血清细胞培养基中Wnt3a蛋白活性迅速丧失。在存在或不存在指定的10%胎牛血清的情况下，在DMEM中孵育经Wnt3a条件化的培养基(50%)或经纯化的Wnt3a(250ng/ml)，在37°C持续指定量的时间。然后使用LSL测定确定剩余的Wnt3a活性。CM:条件化的培养基。
[0052]图3:短半衰期和去污剂相关的毒性限制了经纯化的Wnt3a支持干细胞自我更新的用途。A)无血清ES细胞自我更新测定比较每日或者在每3天传代后添加250ng/ml经纯化Wnt3a对自我更新的作用。当在每次传代后添加Wnt3a时自我