抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体，以及使用该单克隆抗体制备的药物 组合物、试剂盒等应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒 (porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种肠道传染病，主要引起哺乳仔猪呕 吐、水样腹泻、脱水等症状，严重时可造成仔猪的死亡，死亡率能达到50 %-100 %。近年，自 2010年冬季，在我国的大部分地区爆发流行，之后相继在韩国、日本、台湾等地区也大范围 爆发此病。2013年上半年在北美地区也爆发此病，并迅速传播，给全球的养殖业造成了严重 的损失。
[0003] 目前，检测猪流行性腹泻病毒的方法包括病毒分离鉴定和血清检查，但耗时过长； PCR方法虽然灵敏，但需昂贵的仪器和专业的操作人员。因而，现有技术中亟需研制一种简 单、快速、准确检测猪流行性腹泻病毒的产品。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了两个抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体， 以及含单克隆抗体的试剂盒、药物组合物及其应用。
[0005] 本发明涉及一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McABl的可 变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过 一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区 氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、 替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
[0006] 本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段，所述抗体或其片段仍保持特 异性结合猪流行性腹泻病毒的能力。
[0007]本发明还涉及一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-MCAB2的 可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.6所示的氨基酸序列或该序列经 过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变 区氨基酸序列为SEQIDNo.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删 除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
[0008] 本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段，所述抗体或其片段仍保持特 异性结合猪流行性腹泻病毒的能力。
[0009] 本发明还涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的含有所述的 鼠单克隆抗体PEDV-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，以及药学上可接受的载 体。
[0010] 本发明还涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒感染相关 疾病的药物中的应用。
[0011] 本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的具有鼠单克隆抗体 PEDV-McAB1的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，和/或有效量的具有鼠单克隆抗体 PEDV-McAB2的可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病毒 进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
[0012] 本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的具有鼠单克隆抗体 PEDV-McAB1的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，和/或有效量的具有鼠单克隆抗体 PEDV-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗 原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照，其中，所述用于对猪流行性腹泻病 毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二 抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物，所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊 抗鼠二抗。
[0013] 本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McABl、有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体 反应进行检测的检测试剂;其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸 条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有 滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品 垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PEDV-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迀 移;所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PEDV-McAB2,所述硝酸纤维素膜上近 所述底板第二端的位置包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆 抗体PEDV-McABl，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0014] 本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PEDV-McABl、有效量的所述单克隆抗体PEDV-McAB2，以及用于对猪流行性腹泻病毒进行抗原抗体 反应进行检测的检测试剂;其中，所述试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸 条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条;所述酶免疫层析 检测试纸条包括硝酸纤维素膜（1)，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供 应区、样品供应区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所 述底物垫(3)与硝酸纤维素膜（1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜（1)上 向距所述缓冲液供应单元的远端迀移;所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记 的所述单克隆抗体PEDV-McAB2,所述酶底物能与所述单克隆抗体PEDV-McAB2上标记的酶产 生显色反应，所述酶标垫（2)与硝酸纤维素膜（1)接触，所述单克隆抗体PEDV-McAB2溶于缓 冲液中并在硝酸纤维素膜（1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移；以及所述检测区固 定化有所述单克隆抗体PEDV-McABl;其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓 冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中， 所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9) 中；所述检测区包括检测线(6)、质控线(7)，其中，所述质控线(7)较检测线(6)更远离所述 样品供应区，在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PEDV-McABl，在所述质控线(7) 上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体 PEDV-McAB2对于固定在检测线(6)上的所述单克隆抗体PEDV-McAB1而言是过量的；所述硝 酸纤维素膜(1)全段粘附在所述支撑物（10)上，支撑物（10)连接所述缓冲液供应单元，底物 供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最 远端；以及检测样品（11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。
[0015] 本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被所述单克隆抗体PEDV-McABl的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、对猪流行性腹泻病毒进 行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
[0016] 本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被猪流行性腹泻病毒抗原的 ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳 性对照;其中，含所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PEDV-McAB1的反应液、或含 所述单克隆抗体PEDV-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PEDV-McABl与所述单克隆抗体 PEDV-McAB2的混合反应液。
[0017] 本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用。
[0018] 本发明的有益效果:含本发明抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的试剂盒可用于非 诊断目的的猪流行性腹泻病毒检测中的应用或者表位鉴定研究;含本发明抗猪流行性腹泻 病毒单克隆抗体的药物组合物可解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪猪流行性腹 泻病毒感染的问题。
【附图说明】
[0019] 图1为SDS-PAGE凝胶电泳鉴定单克隆抗体PEDV-McABl和单克隆抗体PEDV-MCAB2的 纯度，其中泳道1为蛋白Marker;泳道2为单克隆抗体PEDV-McABl，包括上端的重链和下端的 轻链，泳道3为单克隆抗体PEDV-McAB2，包括上端的重链和下端的轻链。
[0020] 图2为酶免疫层析检测试纸条的侧向示意图，图中：（1)硝酸纤维素膜，（2)酶标垫， (3)底物垫，（4)吸水垫，（5)展开液垫，（6)检测线，（7)质控线，（8)底物缓冲液槽，（9)底物缓 冲液，（1 〇)支撑物，（11)检测样品。
【具体实施方式】
[0021] 以下，对本发明的实施方式进行说明。
[0022] 本发明涉及一种特异性结合猪流行性腹泻病毒的鼠单克隆抗体PEDV-McABl的可 变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过 一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区 氨基酸序列为SEQIDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、 替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
[0023] 术语"猪流行性腹泻病毒"（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)属于冠状 病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，为单股正链RNA病毒，易引起以呕吐、 腹泻、脱水、高死亡为特征的猪流行性腹泻疾病。
[0024] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个 体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该抗体的性质不 是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合 抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗 原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类;也可以是包含抗原结 合结构域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1 ;和双链抗体((1丨3130(1丨68)。融合至另一多肽的、包 含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在 EP.A. 0120694和EP.A. 0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产 生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋 白可变区或互补性决定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区， 参见EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细 胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发 明的"单克隆抗体"也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本 领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用 PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适 的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本 领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过 二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要 结构类别（同型物）。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包 括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区（不同于