一种用于防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，具体涉及一种用于防治大丽轮枝 菌引起的作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)属于子囊菌门真菌，主要以微菌核在土壤、 病残组织、带菌的种子和未经腐熟的土杂肥上越冬，可为害38科660种植物，其中大田作物 包括棉花、向日葵、前子、辣椒、番茄、烟草、马铃薯等，引起的病害称为黄萎病。越冬后的微 菌核萌发，产生大量的分生孢子，分生孢子萌发侵入根毛、根表皮细胞或根部伤口，经过皮 层进入导管，破坏植物的维管束系统，并在侵染过程中产生毒素，导致作物萎蔫死亡给农业 生产带来严重损失。病原菌产生的黑色微菌核具有抗逆性，且具有积累效应，可在土壤中可 存活多年，而引起的作物黄萎病是生产中最难防治的病害之一。
[0003] 长期以来，农业生产中防治黄萎病主要以培育抗病品种和使用化学杀菌剂为主， 但针对大丽轮枝菌的作物抗病性几乎没有获得完全抗病的品种。主要原因是大丽轮枝菌易 变异，新培育的抗病品种很快丧失了抗病性。生产上主要依赖化学杀菌剂，而大量使用化学 药剂对人类健康潜在的危害、对食品和环境的污染、对非靶标生物的影响以及导致病原菌 抗药性的加速发展等问题已经引起社会的日益关注，减量使用化学农药是发展的必然趋 势。
[0004] 随着随经济的发展和人类生活质量的提高，对农产品安全和农业的可持续发展越 来越关注，这也促使了生物防治的发展。几年来国内外大量研究表明，利用拮抗微生物研发 生防制剂，具有广阔的前景。一方面，微生物种群丰富，而且可通过生物工程技术大幅度提 高目标活性物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物制剂本身来源于自然界， 易于降解，对环境友好、安全，已有大量的生防产品应用于植物病害防治。
[0005] 近年来，铜绿假单胞菌在医学上研究越来越多，但在病害生物防治方面研究较少， 目前发现铜绿假单胞菌对水稻纹枯病、烟草青枯病以及茄丝核菌引起的黄瓜和番茄的苗期 粹倒病具有良好防效。铜绿假单胞菌属于假单胞菌类，其拮抗机制主要是分泌胞外活性物 质，主要是抗生素、产生几丁质酶、溶菌酶以及竞争和定殖等。然而，不同的种类，甚至同种 的不同来源株系间的拮抗效果差异很大。
[0006] 由于菌株的多样性，不同铜绿假单胞菌株仍具有不同的抗菌谱、抗菌活性和抗菌 特点，筛选不同作用对象的高效菌株仍是现在乃至今后相对长的一段时间内各国科研工作 关注的方向。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌，该菌株对大丽轮枝菌引起的 棉花黄萎病的防效达86%以上。
[0008] -种铜绿假单胞菌，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)KK9a， 保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)，保藏日期为2015年11月11日，保藏号为:CGMCCNo.11637。
[0009] 该菌株主要形态及生物学特征为:革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，无鞭毛，大小 约为（0.7~0·9μπι)Χ(1·8~3μπι)，菌落边缘不整齐，菌落周围形成透明晕圈。该菌株16S rDNA序列分析显示其与GenBank号为LN890658.1的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)一致性为99%。
[0010] 本发明提供了一种含有所述铜绿假单胞菌的菌剂，该菌剂的浓度优选为IX107~ 1X108CFU/mL，最优选为 1X107CFU/mL。
[0011 ]本发明提供了所述菌剂的制备方法，包括：
[0012] 将所述铜绿假单胞菌接种于培养液中，培养至0D6QQ为0.6~0.8，获得种子液；
[0013] 所述培养液可选用LB液体培养基，其配方为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化 钠1(^/1，调节口!1为7.0~7.2。
[0014] 将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，调节发酵液中铜绿假单胞菌的浓度至1 X107CFU/mL，即获得所述菌剂。
[0015] 其中，所述种子液的接种量优选为1%;所述发酵培养基为:胰蛋白胨10g/L，蔗糖 3g/L，氯化钠2·5g/L，调节pH为7·0~7·2，121°C高压蒸汽灭菌30分钟。
[0016] 本发明中，所述扩大培养是在发酵罐中进行，扩大培养温度在35~37°C之间，培养 时间在48~60h之间，通气比为0.4~2:1，转速为300~600rpm，pH值在7~7.5之间。最终菌 浓度通常可达1X1011~1X1012CFU/mL，调节菌悬液浓度至1X107~1X108CFU/mL施用。
[0017] 本发明提供了所述铜绿假单胞菌在拮抗大丽轮枝菌中的应用。
[0018] 在平板拮抗试验中，本发明菌株对大丽轮枝菌孢子萌发的抑菌圈直径为4.2cm，对 菌丝生长的抑制率达86.1%，菌丝被抑制后不能形成轮枝，出现明显的膨大、消解等畸形现 象。
[0019] 本发明提供了所述铜绿假单胞菌在防治作物黄萎病中的应用。
[0020] 所述作物可以是棉花、向日葵、茄子、番茄、烟草或马铃薯，优选为棉花。
[0021] 防治棉花黄萎病可以按如下方法操作：在棉花3~4叶期，将所述菌剂浇在苗床上 或对植株灌根处理，防治5天后接种大丽轮枝菌，接种20天后，防效仍达86%以上。
[0022]本发明铜绿假单胞菌对大丽轮枝菌具有高效拮抗作用，能用于大丽轮枝菌引起的 作物黄萎病的防治，棉花盆栽试验防效达86%以上，说明该菌株作为生物农药应用具有很 大的潜力。
【附图说明】
[0023]图1为本发明铜绿假单胞菌的电镜图，A标尺5μπι，Β标尺Ιμπι。
[0024] 图2为本发明铜绿假单胞菌对大丽轮枝菌分生孢子的抑制作用，左边为实验组，右 边为对照组。
[0025] 图3为本发明铜绿假单胞菌对大丽轮枝菌菌丝的抑制作用，左边为实验组，右边为 对照组。
【具体实施方式】
[0026]实施例1菌株分离筛选
[0027]供试菌株分离自浙江省杭州市浙江大学华家池校区棉花试验田。
[0028]双层平板法筛选土壤中的生防细菌。将培养4-5天的大丽轮枝菌打菌饼于无菌水 中，配制浓度为1〇6个/mL的孢子悬浮液。取适量（lg)土样于无菌水中配制成土壤悬浮液，系 列稀释至1(Γ2-1(Γ3。双层平板法:将配制的大丽轮枝菌孢子悬浮液均匀涂布PDA上，28°C下 生长48h后，倒LB于PDA上层，均匀涂布土壤悬浮液。将平板置于28°C黑暗条件下培养，待菌 落长出后，挑选有抑菌圈的菌落纯化培养，然后进行复筛。
[0029]筛选共得到1个有生防效果的菌株，命名为KK9a。
[0030]生防菌株对孢子萌发的抑制作用
[0031 ]将初筛得到的菌株接种于LB培养液中培养至培养液OD600为0.6~0.8，获得菌液； 配制大丽轮枝菌的孢子悬浮液，加入到冷却至45°C的PDA中，混合均匀后倒平板，冷却。取高 压灭菌后的牛津杯，置于PDA中央，加入100yL的菌液，低温10°C下扩散2h后置于30°C培养箱 中培养。观察有无抑菌圈形成，若有抑菌圈形成，测量并记录抑菌圈直径。
[0032]菌株KK9a对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制直径达4.42cm(图3)。
[0033] 生防菌株对菌丝生长的抑制作用
[0034] 在PDA培养基中央接种大丽轮枝菌，在其菌落周围将细菌菌液呈三角形划线，置于 25°C培养箱下培养。7(1测定菌丝生长抑制率(生长抑制率=[(1?1-1?2)/1?1]\100%，其中，1?1 为对照病原菌的菌落半径;R2为接细菌的病原菌菌落半径）。
[0035]菌株KK9a对大丽轮枝菌菌丝生长具有较强的抑制效果，抑制率达86.1 % (图2)。 [0036]实施例2菌株的鉴定 [0037] 形态学鉴定
[0038] 菌株在LB培养基上菌落边缘不整齐