越南槐内生细菌b21在防治三七根腐病中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种越南槐内生细菌B21在防治三七根腐病 中的应用。
【背景技术】
[0002] 现代农业对植物病害的防治过度依赖于化学农药的使用，大量化学农药的施放不 仅对生态环境具有长期的破坏作用，也引起农产品品质下降，农药残留超标、病原菌的耐药 性以及对人畜有害等诸多问题。寻找更为安全、有效的病害防治方法具有重大的意义，利用 生物的方法来防治植物病害可以有效解决上述问题。
[0003] 三七(PanaxnotoginsengF.H.chen)又名田七、金不换等，具有显著的活血化瘀、 消肿定痛功效，是一种中国传统名贵药材。以三七为主要原料制成的中成药如"云南白药" 和"片仔癀"等广为流传。近年来，对三七原材料的需求日益增长，但是栽培过程中的真菌病 害严重影响了三七生长。目前，在三七种植上，防治真菌病害过度依赖化学农药，大量化学 农药的使用不仅影响了三七的品质，也造成了三七药材的大量农药残留。
[0004] 三七根腐病为三七主要病害之一，在产区俗称"绿臭"，主要症状为苗期的芽腐及 其芦头和芽基结合处的褐色水渍状病变直至蔓延至整个茎杆基部。该病出苗期就有发生， 4、5月病害停滞，6-9月进入多雨季节，进入发病高峰期。根腐病有多种类型，据报道其症状 大都由三七根腐病菌(Fusariumsolani)(简称F.solani)引起。这个真菌病害是造成多年 来三七产品质量和产量下降的主要原因之一。
[0005]在广西三七的传统道地产区，由于低海拔及高温多湿的气象条件，这种病害往往 是同时发生的，造成了三七的大量减产甚至绝收，给种植户带来了巨大的经济损失。为了控 制这个真菌病害，大量的化学农药被使用，造成了三七产品的大量农药残留，严重的污染了 环境，大大的威胁了人们的健康。因此，开展生物防治三七真菌病害对三七产业的可持续发 展是非常迫切和必要的。为此筛选出能同时拮抗这种病害的拮抗菌具有重大意义，筛选进 而开发利用拮抗菌也是有效控制三七真菌病害最具发展潜力的防治措施之一。
[0006]公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种越南槐内生细菌B21在防治三七根腐病中的应用，从 而能有效的防治三七种植过程中出现的三七根腐病，从而提高三七的产量以及质量。
[0008]为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0009] -种越南槐内生细菌B21，越南槐内生菌B21的分类命名为伯克霍尔德氏菌 (Burkholderiasp.)B21，菌株的16SrDNA基因序列表如SEQIDN0.1所述，保藏单位：中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏日期:2015年05月13日，保藏号:CGMCCNo. 10806。
[0010]优选的是，所述越南槐内生细菌B21代谢产物的制备方法为：将越南槐内生细菌B21接种于NB液体培养基中，置于温度为28°C、转速为130r/min条件下发酵培养10天，所得 发酵物经减压浓缩干燥后，加入发酵物2倍的甲醇并超声40min，然后离心，取上清液减压浓 缩得到菌株发酵物的甲醇粗提物，即为越南槐内生细菌B21代谢产物。
[0011]优选的是，所述越南槐内生细菌B21接种于含1000mlNB液体培养基。
[00?2]优选的是，所述的NB液体培养基含牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，鹿糖10g，培 养基pH值为7.0。
[0013]如上述制备所得越南槐内生细菌B21的代谢产物在防治三七根腐病中的应用。
[0014]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0015]本发明首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株内生细菌(Burkholderia sp. )B21，该菌对三七根腐病菌具有很强的抑制作用，为三七真菌病害的生物防治领域带来 广阔的应用前景。
【附图说明】
[0016]图1是本发明越南槐内生细菌B21与三七根腐病的平板对峙培养，其中F为三七根 腐病菌(Fusariumsolani)，a为空白对照，b为实验组。
[0017]图2是本发明越南槐内生细菌B21菌株形态特征，其中，al为菌落形态，bl为菌体形 ??τ〇
[0018]图3为越南槐内生细菌Β21菌株基于16SrDNA基因序列构建的系统发育树。
[0019]图4是根据本发明菌株越南槐内生细菌B21的代谢产物对三七根腐病菌的菌丝生 长的抑制效果;其中第1列为空白对照即不含药的roA平板;第1排第2~6个为阳性对照多菌 灵粉剂；第2排第2~6个为菌株的B21代谢产物，且浓度分别为0.5mg/mL，lmg/mL，2mg/mL， 4mg/mL，8mg/mL;F为三七根腐病菌Fusariumsolani〇
【具体实施方式】
[0020]下面结合【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体 实施方式的限制。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得 至1J。甲醇为市购分析纯甲醇。2ΧTagMasterMix购自宝生物工程有限公司（Takara)，Primer-1、Primer_2由华大基因合成。
[0021] 实施例1
[0022]菌株的分离、筛选及鉴定
[0023]一、菌株的分离
[0024]供试材料:采自广西天等县石灰岩地区的野生越南槐。
[0025]供试菌株:由广西大学植物病理研究所提供。
[0026]培养基：1000mlNA培养基：牛肉浸膏3g，酵母膏lg，蛋白胨5g，鹿糖10g，琼脂15g，pH7.0〇
[0027] 表面消毒:将长为6-8cm、宽为l-2cm新鲜健康的越南槐根用流水冲洗30min以冲干 净泥沙，然后将洗净的越南槐根用无菌水漂洗2次，风干表面水分，移到超净工作台，在无菌 条件下，将越南槐根用体积浓度为75%乙醇浸泡lmin，无菌水漂洗2次，次氯酸钠(有效氯 1 % )浸泡2min，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干表面备用。
[0028]菌株的分离、纯化:表面消毒好的越南槐根，无菌条件下，用无菌木片刮去表皮，用 无菌枝剪剪去越南槐根的两端，余下部分用无菌小刀和无菌镊子分开木质部和韧皮部，分 别取0.5cm长的组织块，用无菌枝剪剪碎并加无菌水研磨，研磨充分后加无菌水定容至5ml 并静置lOmin，取0.5ml上清液梯度稀释10~105倍，分别取100yL稀释液涂布到ΝΑ平板上，每 个稀释浓度重复3次，取最后一次漂洗液涂布在ΝΑ平板上，作为阴性对照。ΝΑ平板置于培养 箱28°C恒温培养24~96h，挑取不同形态菌落反复划线纯化，将纯化的菌株，即越南槐内生 细菌用20 %甘油保存。
[0029]将分离到的越南槐内生细菌接种于LA平板上，28°C下培养24h后待用。将三七根腐 病菌接种于PDA平板，28°C下培养3天后待用。
[0030]二、筛选
[0031]采用平板对峙法对供试越南槐内生细菌进行菌体抑菌活性的初筛。
[0032]首先，无菌条件下，用灭菌打孔器将三七根腐病菌制成6mm菌饼;在处理中，将三七 根腐病菌菌饼转接到含NA的培养皿中央，然后在距离菌饼2cm的位置，将分离到的越南槐内 生细菌菌株接上一条细菌线，每株内生细菌重复3皿;在对照组中，只接三七根腐病菌菌饼， 不接越南槐内生细菌，重复3皿。然后，在28°C下培养，定期观测。待对照组中真菌长满培养 皿时，在处理组中，测量三七根腐病菌菌饼中心到越南槐内生细菌线中心之间三七根腐病 菌的生长半径为处理生长半径;在对照组中，三七根腐病菌的生长半径为对照生长半径。最 后，根据以下公式，计算抑菌率：
[0033]对照生长量=对照生长半径-菌饼半径 [0034]处理生长量=处理生长半径-菌饼半径
[0036]结果共得到3株对三七根腐病菌抑制作用都很强的拮抗越南槐内生细菌菌株，其 中一株名称为B21，对三七根腐病菌的抑制率为71 %。
[0037]三、鉴定
[0038](一）菌株形态特征
[0039]菌落形态特征观察:将待鉴定的菌株接种在NA培养基上，置于28°C培养24h，观察 菌株的菌落形态特征。
[0040]菌体形态特征观察:取上述在NA培养基上培养24h的菌株进行革兰氏染色并镜检， 将所观察到的形态结果显微照相，如图2所示。
[0041](二)菌株16S rDNA序列及其系统发育学分析
[0042] DNA模板的制备：
[0043]试剂：（1)裂解缓冲液：Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTAlmM，SDSl%(w/ v)；
[0044] (2)5MNaCl溶液。
[0045] DNA提取：
[0046] (a)将1.5ml细菌过夜培养液培养物置于微量离心管（EP管）内，12000rpm离心 0.5min，弃去上清液，保留沉淀物；
[0047] (b)在沉淀物中加入400μ1裂解缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬；
[0048] (c)加入200ul5ΜNaCl，充分混匀，12000rpm离心lOmin，取600μ1 上清液；
[0049] (d)加入等体积的酚/氯仿（1:1)，混匀，离心（12000rpm，10min)，将上清液转入另 一干净的EP管中；
[0050] (e)向步骤(d)中获得的上清液中加入等体积氯仿，混匀，离心（12000rpm，lOmin)， 将上清液转入另一干净的EP管中；
[0051] (f)向步骤(e)中所得上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，置于室温lOmin，离心 (12000rpm，15min)，弃去上清液，保留沉淀物；
[0052] (g)用体积浓度为70%乙醇洗涤步骤(f)所得沉淀物，晾干，即为DNA;
[0053] (h)将步骤(g)中已干的DNA溶于30μ1双蒸水(ddH20)中，-20°C保存。
[0054]PCR扩增16SrDNA序列：
[0055] (l)PCR仪：ABI3730-XLDNA测序仪（AppliedBiosystems，USA)
[0056] (2)扩增引物：27F(5/-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 /)如SEQIDN0·