减毒鼠伤寒沙门氏菌及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及减毒鼠伤寒沙门氏菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是大多数革兰氏阴性菌外膜上重要的组成成分，是细菌重要的毒力因子，就鼠伤寒沙门氏菌而言，完整的LPS对其入侵宿主细胞，并以沙门小体(Salmonella-containing vacuole(SCV))的形式稳定的存在于各类细胞(如DC细胞，巨噬细胞)等起着重要促进的作用，它直接关系到致病菌对宿主的感染能力。CA是一种类似于0抗原的糖单元多聚复合物，通常只在细菌遭遇不利条件下，如低温，低渗，缺乏营养物质等，才会被诱发并大量表达的，且主要游离地分布在胞外，构成b1film的主要成分，对细菌起保护支撑的作用，有时可疏松的与细菌外膜相连接，偶尔可以代替0抗原与lipid A进行连接形成一种新的组合物MLPS(XA与沙门氏菌的毒力因子无关，且免疫源性极低，但有研究表明，CA的缺失有助于减毒沙门氏菌疫苗产生更多的针对其所递送的外源抗原的免疫性抗体，激发更好的免疫反应，尤其是黏膜免疫，有利于减毒沙门氏菌疫苗的进一步开发。
[0003]—般而言，一株理想的减毒沙门氏菌疫苗或递送外源抗原的载体应该是在减毒的同时保留有与野生株相当的抵抗宿主胃酸、胆盐以及能成功粘附、入侵肠上皮细胞继而可定殖于浅层和深层淋巴组织的能力，激发宿主产生相应的免疫反应，起到相应的免疫保护作用。
[0004]然而，对于鼠伤寒沙门氏菌而言，LPS中0抗原的生物合成代谢途径一旦受阻，其毒力会大大减弱，同时减毒菌株对宿主的各类抵抗力将会下降，进而严重影响细菌免疫应答水平；因此如何找到能使得所得菌株的免疫应答水平不受影响，且减毒效果好的鼠伤害沙门氏菌是一个比较重要且亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typimurium S116，其特征在于，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typimurium SI 16缺失rfbK和cpsG基因；所述减毒菌株的分类命名为Salmonella typimurium S116，保藏于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心(武汉大学)中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Μ2015635，保藏时间为:2015年10月23日。
[0006]而本发明中，所得菌株缺失了rfbK和cpsG基因，其均可产生磷酸甘露糖酶，均可参与到0抗原多聚糖链中甘露糖单糖的生物合成，所以，缺失掉rfbK和cpsG基因后，鼠伤寒沙门氏菌的LPS和CA均不能正常合成，细菌在面对来自宿主机体的各类抵抗能力更会受到严重影响。但本发明的发明人发现仅需简单的在体外培养基添加甘露糖，便可以使其体外生长时可正常的合成完整LPS和CA，这样可在鼠伤寒沙门氏菌进行有效减毒的同时，保持了其对宿主的相应抵抗力。
[0007]本发明的发明人经过大量的实验摸索，首次发现了在鼠伤寒沙门氏菌0抗原的生物合成过程中，参与CA合成的cpsG和cpsB基因在功能上可完全互补rfbK和rfbM的基因功能。因此，rfbK和cpsG基因或者rfbM和cpsB基因的同时缺失可完全阻断沙门氏菌LPS和CA的合成。在早期体外培养阶段时额外的添加进甘露糖，减毒鼠伤寒沙门氏菌便可利用体外的甘露糖合成完整的LPS和CA，使得细菌在感染宿主初期具备与野生菌株一样的抵抗宿主生存压力的能力。细菌定殖入宿主机体以后，由于体内甘露糖的缺乏，LPS和CA便不再合成，毒力得到显著降低。
[0008]因此，本领域人员应当理解，同时缺失rfbM和cpsB基因的突变株，同样具有很好的减毒效果。
[0009]本发明的第二个目的在于提供上述减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建方法，该构建方法包括如下步骤:
利用自杀质粒介导的同源重组方法，将鼠伤寒沙门氏菌细菌基因组上的rfbK基因和cpsG基因或rfbM基因和cpsB基因敲除，得到不含有rfbK基因和cpsG基因或不含有rfbM基因和cpsB基因的突变株。
[0010]所述自杀质粒介导的同源重组方法包括如下步骤:
(1)构建自杀性质粒pYA4278-rfbK 或 pYA4278-rfbM;pYA4278-cpsG 或 pYA4278-cpsB;
(2)将步骤(1)所得自杀性质粒电转导入Apir大肠杆菌，并与鼠伤寒沙门氏菌进行自然混合培养，使自杀性质粒从大肠杆菌中转移到鼠伤寒沙门氏菌内，并与鼠伤寒沙门氏菌基因组中的同源区域进行交叉互配，最终使得整个自杀质粒得以整合进基因组当中，经过Cm+抗性筛选，得到第一次同源重组后的阳性克隆菌；
(3)液体LB培养基中(不带Cm+抗性)继续培养阳性克隆菌，使其自发的发生第二次同源重组，用含有10%的蔗糖且不含氯化钠的固体培养基筛选，得到对氯霉素敏感而对蔗糖有抗性的克隆；
(4)通过PCR筛选得到不含rfbK和cpsG基因或不含rf bM和cpsG基因的突变菌株。
[0011 ]所述自杀质粒pYA4278-rfbK； pYA4278_cpsG ；pYA4278_rfbM 及pYA4278_cpsB的构建步骤如下:
含有rfbK基因上下游同源臂的自杀性质粒pYA4278-rf bK的构建:
根据NCBI Genbank公布的鼠伤寒沙门氏菌UK-1全基因组序列，序列号为:CP002614，设计扩增rfbK基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，运用SnapGene软件设计下述引物:
DrfbK-lF: 5’ ACAGACGCTTTACTGGTGGC 3’
DrfbK-lR: 5’ CCTCTGACCTTAACTACGTTCATTAGTCC 3’
DrfbK-2F: 5’ ACGTAGTTAAGGTCAGAGGGTGAGGATTA 3’
DrfbK-2R: 5’ AACGCTATCAGAGCCAAATC 3’
提取处于对数生长期S100基因组DNA作为模板，利用引物DrfbK-lF和DrfbK-lR，进行PCR扩增，得到上游同源臂产物，再利用引物DrfbK-2F和DrfbK-2R进行扩增，得到下游同源臂产物，最后利用引物DrfbK-lF以及DrfbK-2R，以上下游同源臂混合产物为模板，进行扩增，得到融合的上下游同源臂扩增产物，再利用加A(A碱基)反应试剂盒在PCR产物片段末端进行加A处理，并与用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接，最后转入Apir大肠杆菌中，得到重组质粒pYA4278-rfbK;将重组质粒转入至需要DAP才能生长的Apir大肠杆菌内以便进行后续突变株的构建；
含有cpsG基因上下游同源臂的自杀性质粒pYA4278-cpsG的构建:
根据NCBI Genbank公布的鼠伤寒沙门氏菌UK-1全基因组序列，序列号为:CP002614，设计扩增cpsG基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，运用SnapGene软件设计下述引物:
DcpsG-lF: 5’ ACATGCACCGCGAGGTTTAC 3’
DcpsG-lR: 5’ TCTGACGTTATTACCGGGCATAATTGCAGGCG 3’
DcpsG-2F: 5’ GCCCGGTAATAACGTCAGATCTCCCCTTACCG 3’
DcpsG-2R: 5’ GCCAGGTGGCGAGGCGGTTG 3’
提取处于对数生长期S100基因组DNA作为模板，利用引物DcpsG-lF和DcpsG-lR，进行PCR扩增，得到上游同源臂产物，再利用引物DcpsG-2F和DcpsG-2R进行扩增，得到下游同源臂产物，最后利用引物DcpsG-lF以及DcpsG-2R，以上下游同源臂混合产物为模板，进行扩增，得到融合的上下游同源臂扩增产物，再利用加A(A碱基)反应试剂盒在PCR产物片段末端进行加A处理，并与用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接，最后转入Apir大肠杆菌中，得到重组质粒pYA4278-CpsG，将重组质粒转入至需要DAP才能生长的Apir大肠杆菌内以便进行后续突变株的构建。
[0012]含有rfbM基因上下游同源臂的自杀性质粒pYA4278-rfbM的构建:
根据NCBI Genbank公布的鼠伤寒沙门氏菌UK-1全基因组序列，序列号为:CP002614，设计扩增rfbM基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，运用SnapGene软件设计下述引物:
DrfbM-lF: 5’ GCTGCCTATCGCCGTTCCG 3’
DrfbM-lR: 5 ’GGTGCGCCCAATCCAGCCGCCAGCCATAATTACGGGAAGAAAAGACAT 3，
D rfbM-2F: 5'TGGATTGGGCGCACCCGTTCTGGATTTTCGAAGGAGTGGAC 3’
D rfbM-2R: 5’ GGATCGCAGCCTCATCATG 3’
提取处于对数生长期S100基因组DNA作为模板，利用引物DrfbM-lF和DrfbM-lR，进行PCR扩增，得到上游同源臂产物，再利用引物Drf bM-2F和Drf bM-2R进行扩增，得到下游同源臂产物，最后利用引物DrfbM-lF以及DrfbM-2R，以上下游同源臂混合产物为模板，进行扩增，得到融合的上下游同源臂扩增产物，再利用加A(A碱基)反应试剂盒在PCR产物片段末端进行加A处理，并与用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接，最后转入Apir大肠杆菌中，得到重组质粒pYA4278-rfbM;将重组质粒转入至需要DAP才能生长的Apir大肠杆菌内以便进行后续突变株的构建；
含有cpsB因上下游同源臂的自杀性质粒pYA4278-cpsB的构建:
根据NCBI Genbank公布的鼠伤寒沙门氏菌UK-1全基因组序列，序列号为:CP002614，设计扩增cpsB基因的上游同源臂和下游同源臂的引物序列，运用SnapGene软件设计下述引物:
DcpsB-lF: 5’ CGCGGAACGATTACGCGATCG 3’
DcpsB-lR: 5’CGGCTTATCCGTAGGACGTCATCCCCGAATATCTGCAATAAATTGGCG 3’
DcpsB-2F: 5’CGTCCTACGGATAAGCCGCGCCTGCAATTATGCCCGGTAAGC 3’DcpsB-2R: 5’ CGCGCACCAGCTTCATACCG 3’
提取处于对数生长期S100基因组DNA作为模板，利用引物DcpsB-lF和DcpsB-lR，进行PCR扩增，得到上游同源臂产物，再利用引物DcpsB-2F和DcpsB-2R进行扩增，得到下游同源臂产物，最后利用引物DcpsB-lF以及DcpsB-2R，以上下游同源臂混合产物为模板，进行扩增，得到融合的上下游同源臂扩增产物，再利用加A(A碱基)反应试剂盒在PCR产物片段末端进行加A处理，并与用Ahdl酶切后得到pYA4278酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接，最后转入Apir大肠杆菌中，得到重组质粒pYA4278-CpsG，将重组质