用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培养液及其制备方法，具体涉及用于培养病毒的无血清培养液及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 1996年以来，哺乳动物细胞培养已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化 生产。许多生物活性物质、疫苗、载体，如单克隆抗体、药用蛋白质、高职病性蓝耳病疫等， 都可以通过动物细胞大规模培养获得。通过细胞培养生产生物制品既能提高生物制品的质 量，又能促进细胞培养技术、蛋白质表达纯化技术、病毒培养技术等的发展。
[0003] 目前，兽用疫苗很多都需要通过细胞培养来进行生产，在生产过程需要使用血清。 血清培养存在成分不明确;保存期短;取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响， 可能导致实验失败或实验结果不可靠性;制作过程复杂、批间差异大，成分不能保持一致， 使用使得实验和生产的标准化困难;质量不稳定，价格昂贵，进出口管制影响盈利.，使用不 方便等缺点。而无血清培养可以消除来自血清的不均一性;降低生产成本，简化分离纯化步 骤，避免病毒污染造成的危害;提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异 的影响;供应充足、稳定。因此从当前发趋势来看无血清培养，是近年世界范围内各大生物 公司产业化生产的发展方向。
[0004] 中国专利申请201410467191.2公开了无血清培养基及其用途和一种猪瘟病毒的 培养方法，无血清培养基，所述无血清培养基为pH为7.0~7.5的水溶液，其组分如下:MEM 基础培养基;丙酮酸钠;大豆蛋白水解物;胆固醇;碱性成纤维细胞生长因子;抑制素B;胰岛 素;L-丙氨酸;L-缬氨酸;L-亮氨酸;L-异亮氨酸;L-甲硫氨酸;L-脯氨酸;L-苯丙氨 酸;L-色氨酸;L-甘氨酸;L-丝氨酸;L-苏氨酸;L-半胱氨酸;L-天冬酰胺;L-谷氨酰 胺;L-酪氨酸;L-天冬氨酸;L-谷氨酸;L-赖氨酸;L-精氨酸;L-组氨酸;羟脯氨酸；豆 蔻酸;棕榈酸;棕榈油酸;硬脂酸;精胺;亚精胺;还原型谷胱甘肽；乙醇胺;β-巯基乙醇;甘 油；生物素；吡哆醇；抗坏血酸；维生素Β-12;次黄嘌呤；胸苷;NaH⑶3 ;FeS047H20;ZnS04; Na2Se03;朽1檬酸铁。该培养基成分复杂，不利于制备，生产成本高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种生产成本低，易于制备的用于培养病毒的培养液及其 制备方法。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：用于培养病毒的无血清培养液， 包括DMEM培养基，还包括如下组分及其浓度:胰岛素5~45mg/L、牛血清白蛋白0.5~3mg/ mL、微量元素0.1~2mg/L、酵母提取物0.2~3g/L、氨基酸溶液2~5 mg/L、纤连蛋白0.2~ 1.5mg/mL、辅酶R 0.01~0.15mg/L、烟酸0.5~2mg/L和维生素C 0.5~2 mg/L。
[0007] 优选地，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，还包括如下组分 及其浓度:胰岛素5 mg/L、牛血清白蛋白0.5mg/mL、微量元素0.5mg/L、酵母提取物0.2g/L、 氨基酸溶液2mg/L、纤连蛋白0.2mg/mL、辅酶RO.Olmg/L、烟酸0.5mg/L和维生素C0.5mg/L〇
[0008]优选地，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，其特征在于还包 括如下组分及其浓度:胰岛素25mg/L、牛血清白蛋白2mg/mL、微量元素lmg/L、酵母提取物 1.5g/L、氨基酸溶液2.5mg/L、纤连蛋白lmg/mL、辅酶R0.5mg/L、烟酸lmg/L、维生素Clmg/ L〇
[0009]优选地，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，其特征在于还包 括如下组分及其浓度:胰岛素45mg/L、牛血清白蛋白3mg/mL、微量元素2mg/L、酵母提取物 3g/L、氨基酸溶液5mg/L、纤连蛋白1.5mg/mL、辅酶R0.15mg/L、烟酸2mg/L和维生素C2 mg/L〇
[0010] 优选地，所述氨基酸溶液由以下重量份数的组分组成:甘氨酸0.2~1份、异亮氨酸 0.5~2份、丝氨酸0~1.5份、丙氨酸0.1~1.5份、苯丙氨酸0.1~0.5份、酪氨酸0.1~2份、缴氨酸 0.2~1.5份、脯氨酸0.1~0.5份、半胱氨酸0.5~2份、亮氨酸0~1份、色氨酸0.5~2份、蛋氨酸0.5 ~1.5份、天冬酰胺0.05~0.25份、谷氨酰胺0.5~2.5份、苏氨酸0.2~1.5份、天冬氨酸0.05~2 份、谷氨酸(M). 5份、赖氨酸0.5~1份、精氨酸0.1~0.5份、组氨酸(M). 5份和蒸馏水5~10份。
[0011] 优选地，所述氨基酸溶液由以下质量百分数计的组分组成:甘氨酸0.5份、异亮氨 酸1份、丝氨酸0.6份、丙氨酸1份、苯丙氨酸0.3份、酪氨酸1.5份、缬氨酸1份、脯氨酸0.2份、 半胱氨酸0.8份、亮氨酸0.5份、色氨酸1.2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.15份、谷氨酰胺1.5 份、苏氨酸0.9份、天冬氨酸1份、谷氨酸0.3份、赖氨酸0.6份、精氨酸0.3份、组氨酸0.3份和 蒸馏水8份。
[0012] 优选地，所述微量元素由硒、铜、钴、锌、镍按1~2:1.5~3:1~1.5: 2~3:1~1.5的重量 比组成。
[0013] 优选地，所述培养液的pH为7.0~7.2。
[0014]本发明还提供了所述的用于培养病毒的培养液的制备方法，包括以下步骤:取配 方量的DMEM培养基溶于1000ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提 取物、氨基酸溶液、纤连蛋白、辅酶R、烟酸和维生素C，充分混合，调节pH，即得。
[0015] 优选地，所述氨基酸溶液由如下方法制备:取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、 丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的蒸馏 水中，得到氨基酸溶液。
[0016]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明用于培养病毒的培养液，在接种病毒 后，为细胞的培养和扩增中提供了细胞生长所需的足够的营养物质，并且通过各种成分的 配比，保证其生长分裂情况良好、增殖获得的细胞完整，经本发明培养液培养的病毒具有效 价高、质量好的优点；此外，该培养液的制备方法简单、易操作，降低了病毒生产成本，便于 实现大规模生产的需要。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
[0018] 本发明中的各组分均为常规市售产品，例如DMEM培养基为GibcoDMEM干粉培养基 (高糖，含丙酮酸钠），货号12800017。
[0019]实施例1:用于培养病毒的无血清培养液。
[0020] -种用于培养病毒的无血清培养液，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括 DMEM培养基，还包括如下组分及其浓度:胰岛素5mg/L、牛血清白蛋白0.5mg/mL、微量元素 0 · 5mg/L、酵母提取物0 · 2g/L、氨基酸溶液2mg/L、纤连蛋白0 · 2mg/mL、辅酶R0 · 01mg/L、烟 酸0.5mg/L和维生素C0.5mg/L。
[0021] 其中，所述氨基酸溶液由以下质量百分数计的组分组成:甘氨酸0.2份、异亮氨酸 0.5份、丝氨酸0.2份、丙氨酸0.1份、苯丙氨酸0.1份、酪氨酸0.1份、缬氨酸0.2份、脯氨酸0.1 份、半胱氨酸0.5份、亮氨酸0.2份、色氨酸0.5份、蛋氨酸0.5份、天冬酰胺0.05份、谷氨酰胺 0.5份、苏氨酸0.2份、天冬氨酸0.05份、谷氨酸0.1份、赖氨酸0.5份、精氨酸0.1份、组氨酸 0.1份和蒸馏水5份;所述微量元素由硒0.1份、铜0.1份、钴0.1份、锌0.1份和镍0.1份组成。 [0022]所述用于培养病毒的无血清培养液的制备方法，包括以下步骤:取配方量的DMEM 培养基溶于l〇〇〇ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提取物、氨基酸 溶液、纤连蛋白、辅酶R、烟酸、维生素C，充分混合，调节pH，即得。
[0023]所述氨基酸溶液由如下方法制备:取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、 苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的蒸馏水 中，得到氨基酸溶液。
[0024]实施例2:用于培养病毒的无血清培养液。
[0025] -种用于培养病毒的无血清培养液，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括 DMEM培养基，其特征在于还包括如下组分及其浓度:胰岛素25mg/L、牛血清白蛋白2mg/mL、 微量元素lmg/L、酵母提取物1.5g/L、氨基酸溶液2.5mg/L、纤连蛋白lmg/mL、辅酶R0.5mg/L 、烟酸lmg/L和维生素Clmg/L。
[0026] 其中，所述氨基酸溶液由以下重量份数的组分组成:甘氨酸0.5份、异亮氨酸1份、 丝氨酸0.6份、丙氨酸1份、苯丙氨酸0.3份、酪氨酸1.5份、缬氨酸1份、脯氨酸0.2份、半胱氨 酸0.8份、亮氨酸0.5份、色氨酸1.2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.15份、谷氨酰胺1.5份、苏氨 酸〇.9份、天冬氨酸1份、谷氨酸0.3份、赖氨酸0.6份、精氨酸0.3份、组氨酸0.3份和蒸馏水8 份;所述微量元素由硒〇.2份、铜0.2份、钴0.2份、锌0.2份和镍0.2份组成。
[0027]所述用于培养病毒的无血清培养液的制备方法，包括以下步骤:取配方量的DMEM培养基溶于l〇〇〇ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛