聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用，具体为以聚乙烯醇为骨架 材料的用于贴壁哺乳动物细胞培养用的微载体及其制备方法。将聚乙烯溶液乳化成微米级 液滴，经适当交联、筛分得到一定粒径范围的微球，其可不经修饰直接用于贴壁哺乳动物细 胞的发酵培养。聚乙烯醇价格低廉，对环境友好，生物相容性好，以其制备的微载体适合哺 乳动物细胞贴壁生长。本发明的微载体可广泛应用哺乳动物贴壁细胞发酵生产酶、生长因 子、疫苗和单克隆抗体等生物制品，涉及的技术领域包括生物医药、酶工程、发酵工程等。
【背景技术】
[0002] 1967年VanWezel为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了微载体培养系统的新技术 概念。经过几十年的研究改进，微载体培养技术现已广泛地应用于哺乳动物细胞的培养，已 广泛用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等。
[0003] 基于微载体适用于贴壁依赖性细胞在其表面贴壁生长，微载体能成为迄今常用而 有效的哺乳动物细胞培养载体，除了由于许多工程依赖贴壁细胞系生产的限制外，还因微 载体具有以下的优点兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养;@细胞所处环 境均一;③环境条件(温度、pH、C02等)容易测量与监控;1)具有较高的比表面;⑤培养操作 可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。
[0004] 目前市面上销售的微载体从材料上可分为：葡聚糖微载体（比如GE的Cytodex系 列）、聚苯乙稀微载体（比如Pall公司的Solohill、Corning公司的Synthemax)、明胶微载体 (比如？61'〇61113;[0171:;^3 413公司的(]1111:丨8口1161')和纤维素微载体（比如1(;[1'；[11公司的 Ce11snow、Pharmac ia公司的Cy topore)等。从表面修饰材料可分为：带正电的己二胺（比如 GE的Cytodex1)、哺乳动物胶原（比如GE的Cytodex、PALL公司的Solohill)、人纤连蛋白 (比如PALL公司的Solohill(ProNectin F coated))。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种聚乙烯醇微载体及其制备方法与应用。将聚乙烯醇溶 液乳化成微米级液滴，经适当交联、筛分得到一定粒径范围的微球，其可不经修饰直接用于 贴壁哺乳动物细胞的发酵培养。由于聚乙烯醇价格低廉，对环境友好，生物相容性好，以其 制备的微载体适合哺乳动物细胞贴壁生长。本发明的微载体可广泛应用哺乳动物贴壁细胞 发酵生产酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等生物制品的生产等。
[0006] 本发明提供的聚乙烯醇微载体是通过反向悬浮将聚乙烯醇溶液在油相中分散成 球形小液粒，通过交联剂对聚乙烯醇进行交联，经过固化、洗涤和筛分步骤得到聚乙烯醇微 球;微载体的粒径为60~250μπι，微载体的密度为1.02~1.07g/cm3。
[0007] 本发明中所用的聚乙烯醇的醇解度为10%~100%(优选80%~95%)，粘度在10~100 mPa.s(优选15~50mPa.s)在常温或加热条件下溶于水中，配制成质量分数为1%~20%(优 选5%~15%)的溶液。
[0008]本发明中所用的交联剂为双醛类、双环氧类、双酸酐类和双酰氯类化合物。
[0009]本发明提供的聚乙烯醇微载体的制备方法包括如下步骤： 1) 配制由烷烃、脂肪酸、酯类化物等疏水有机化物和亲水亲油平衡值(HLB值)小于7的 乳化剂作为油相;pH为1~2(加入无机酸)聚乙烯醇溶液作为水相； 2) 充分搅拌下，将水相缓慢加入油相中形成稳定的小液滴。
[0010] 3)然后加入双醛类、双环氧类、双酸酐类或双酰氯类的交联剂，进行反应交联，固 化聚乙烯醇微球。
[0011] 4 )待聚乙烯醇微球固化成形后，滤出微球，用5~20倍体积的热水(50~100°C)清 洗3次，再用2~20倍体积的乙醇清洗3次，最后用2~20倍体积的石油醚清洗3次。
[0012] 5)清洗完毕在加热或真空条件下烘干，去除残留的有机溶剂。将聚乙烯醇微载体 放入纯水中，充分浸泡，最后，先用100目不锈钢筛网滤掉其中粒径过大的微球，再用180目 的不锈钢筛网滤掉其中粒径过小的微球。
[0013] 6)将得到的微球样品浸泡于pH=7的磷酸缓冲溶液中（如果需长时间保存也可浸泡 20%的乙醇溶液中）备用。
[0014]通过以上方法制备聚乙烯醇微载体的特点：粒径为60~250μπι，密度为1.02~ 1.06g/cm3〇
[0015]本发明提供的一种聚乙烯醇微载体的制备方法包括如下步骤： 1)将200g10%的聚乙烯醇溶液加入含有2gspan-80的300mL液体石蜡中，用盐酸调pH为 1 ~2,40-65°C下，以200 -280rpm速度进行搅拌5-10min; 2)降温至40°C，以280rpm速度继续搅拌20-30min;加入50%的戊二醛3.5mL，保持温 度40°C，以280rpm速度继续搅拌50-60min;升温至60°C，继续搅拌50-60min; 3) 停止反应，滤出微球，用10倍体积的70 ± 10°C热水清洗3-4次，再用5倍体积的乙醇清 洗3-5次，最后用4-5倍体积的石油醚清洗2-3次。经80°C烘干后，去除残留的试剂。
[0016] 4)筛分:将得到的聚乙烯醇微载体放入纯水中，充分浸泡6-8小时，先用用100目的 不锈钢筛网进行筛分，去除大于100目筛孔的微载体;余下的微载体用180目不锈钢筛子对 微球进行筛分，保留大于180目筛孔的微载体，即可得到所需的微载体。
[0017]本发明得到的聚乙烯醇微载体应用哺乳动物贴壁细胞发酵生产酶、生长因子、疫 苗和单克隆抗体等生物制品的生产。
[0018]将聚乙烯醇微球用于细胞培养前，需将其浸泡液更换为新鲜的pH为7的磷酸缓冲 盐溶液，经121°C湿热灭菌30~60°C后，可直接加入培养基中用于细胞的发酵培养。
[0019]本发明以聚乙烯醇为原料制备的微载体不需用表面修饰，可直接用于哺乳动物细 胞的发酵培养，制备工艺更加简单。聚乙烯醇是一种高分子有机化合物，对人体无毒、无副 作用，具有良好的生物相容性。聚乙烯醇在医疗领域具有广泛使用，可以制成水凝胶，制造 软性接触眼镜;可以制成口腔膜，贴于患处，治疗细菌感染;还可以制成医用海绵，用于手术 中吸液、吸血。聚乙烯醇可通过石油乙烯法、天然气乙炔法和电石乙炔法等成熟方法进行， 生产方便，易于获取，价格低廉。另外聚乙烯醇不同于其它乙烯基聚合物（比如聚苯乙烯）， 其可被细菌作为碳源利用，可降解，是一种环境友好的材料。以聚乙烯醇为基质形成的微载 体可不用具有神经毒性的己二胺修饰，更加环保;也不需要用哺乳动物源材料胶原或纤维 蛋白修饰，避免生产过程引入哺乳动物源材料所带来的生物安全性风险。
[0020]实验证明，哺乳动物贴壁细胞能在上述制备的以聚乙烯醇为骨架材料的微载体上 进行良好的贴附，适合于哺乳动物细胞的大规模发酵生产。
【附图说明】
[0021 ]图1为聚乙烯醇微球照片（X100)。
[0022] 图2为湿热灭菌30min后显微镜下观察（X100)。
[0023] 图3为湿热灭菌60min后显微镜下观察（X100)。
[0024]图4为vero细胞在聚乙烯醇微载体上的贴壁效果（X200)。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件;所用的通 用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。