用于提高杂交瘤细胞克隆数量的添加剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于提高杂交瘤细胞克隆数量的添加剂及其制备方法，属于生物及医 药领域。
【背景技术】
[0002] 免疫学是当今医疗和科研必不可少的一部分。自40年前Edelman和Porter率先分 离出免疫球蛋白分子之后，抗体已被应用于很多方面。抗体应用于蛋白质组学和诊断学方 面以检测肿瘤和细菌抗原；还可以在山羊奶和植物中合成以作为疫苗和抗肿瘤因子;还可 用作药物载体工具以治疗病毒、细菌感染和肿瘤。
[0003]杂交瘤技术及单克隆抗体的生产为研究工作带来了革命，提供了无数的、独特的 单克隆抗体试剂，用于特异性抗原的鉴定、分离、清除、活化或检测等。制备分泌抗体的B细 胞杂交瘤细胞依赖于抗原反应性B细胞与永生化的骨髓瘤细胞高效率的融合，以及随后的 鉴定和对能持续生长的能产生特异性抗体的细胞系的分离。在细胞融合的过程中，细胞会 受到不同程度的损伤。为了使融合后的杂交瘤细胞获得最佳生长条件、增加杂交瘤的产量， 在杂交瘤细胞克隆化培养中，需要添加一些额外的生长因子或补充物。有些实验室会使用 滋养细胞层(脾细胞或腹腔巨噬细胞）。滋养层的作用一般认为有如下几个方面：1、产生某 些细胞因子来调节杂交瘤细胞的生长;2、增加细胞浓度以促进单个或少数分散杂交瘤密度 依赖细胞的繁殖(单克隆抗体-杂交瘤技术讲义，第四军医大学微生物学教研室编）；3、吸收 某些有害的代谢产物；4、吞噬清除死细胞及其碎片；5、抑制可能的污染的微生物的生长 (KeithJames,eta.Humanmonoclonalantibodyproductioncurrentstatusand futureprospects.JImmunolMeth1987; 100:5)等。除了饲养层细胞，也可以使用IL-6来 源的商品化的添加物(OrigenHCF.IGENInc，Gaithersburg，MD)。然而，在制备饲养层细胞 时，每次融合都要杀掉4-5只小白鼠，不利于动物福利，而商品化的杂交瘤添加物价格又比 较昂贵。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种用于提高杂交瘤细胞克隆数量的添加剂，既能够有效促进杂交瘤 细胞的生长，又能降低生产成本并保护动物，满足科研和医疗的需求。
[0005] 本发明提供的技术方案如下：
[0006]用于提高杂交瘤克隆数量的添加剂的制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)获取可表达IL-6蛋白的真核细胞的培养液上清，所述细胞培养液上清中含有 表达的IL-6蛋白；
[0008] (2)对细胞培养液上清进行超滤，然后过滤除菌，获得细胞培养液上清浓缩液；
[0009] (3)向细胞培养液上清浓缩液中加入亚硒酸钠，获得所述添加剂。
[0010] 本发明的技术方案中，所述超滤是指，用截留高分子量的超滤管对细胞培养上清 进行超滤后，再用截留低分子量的超滤管对滤过液进行浓缩;所述过滤除菌是指，用〇. 22μπι 的滤膜对浓缩后的细胞培养上清进行过滤。
[0011]本发明的一些技术方案中，所述截留高分子量的超滤管的规格选自30KD、50KD和 100KD中的任何一种，所述截留低分子量的超滤管的规格选自3KD、5KD和10KD中的任何一 种。其中一组优选为:所述截留高分子量的超滤管的规格50KD，所述截留低分子量的超滤管 的规格10KD。
[0012]本发明的技术方案中，优选所述亚硒酸钠的终浓度为lmg/L-10yg/L。
[0013] 本发明的技术方案中，优选可表达IL-6蛋白的真核细胞选自转化有可表达IL-6蛋 白的重组表达载体的CH0细胞系。所述真核细胞进一步优选CH0细胞系中Flp-In-293。
[0014] 本发明的技术方案中，优选所述重组表达载体为pcDNA5/FRT-IL6,是以pcDNA5/ FRT为骨架，pcDNA5/FRT和IL-6全长cDNA经过用ΚρηΙ和Xbal双酶切，经过电泳、切胶回收后， 用T4DNA连接酶过夜连接，连接产物转化感受态细胞E.coliDH5a，涂布Amp平板并挑取单菌 落鉴定，鉴定正确的阳性克隆的质粒命名为PCDNA5/FRT-IL6。
[0015]在本发明的大多数技术方案中，所述培养液上清采用真核细胞生长初期的培养液 上清，所述生长初期指培养不超过48小时。真核细胞在生长初期会分泌大量各种生长因子， 可以刺激细胞快速生长，这些浓缩液作为添加剂加入到杂交瘤培养液中，可以提高杂交瘤 细胞的成活率。
[0016]本发明还请求保护采用采用上述任一制备方法制备而得的用于提高杂交瘤细胞 克隆数量的添加剂。
[0017]本发明提供的添加剂可以用于制成杂交瘤细胞的培养基，其特征在于，是在含有 1 〇 %胎牛血清的DMEM中添加所述的添加剂，优选添加的所述添加剂的体积比例为1 % -80%，进一步优选为5%-75%，进一步优选为5%-70%，进一步优选为5%-65%，进一步优 选为5 %-60 %。从本发明的实验数据可以看出，添加本发明添加剂在20 %左右效果最优，降 低比例或者提高比例，其培养的细胞克隆数提高量都是递减的，但是可以看出添加比例在 1-80%之间任一数值都能起到提高克隆数的作用。
[0018]本发明基于上述添加剂，还请求保护培养杂交瘤细胞的方法，其特征在于，在其培 养基中添加上述添加剂，或采用所述杂交瘤细胞的培养基。
[0019]本发明用于提高杂交瘤克隆数量的添加剂，以人工培养的含有IL-6蛋白的细胞培 养液上清为原料超滤浓缩后，加入亚硒酸钠后即得。可作为杂交瘤促生长因子使用。本发明 提供的添加剂除了里面含有IL-6和亚硒酸钠等传统的细胞添加剂外，含还有真核细胞生长 过程分泌的各种生长因子，可以刺激细胞快速生长，这些浓缩液作为添加剂加入到杂交瘤 培养液中，可以提高杂交瘤细胞的成活率，制备方法操作简单、成本价格低廉。亚硒酸钠有 抗氧化作用，提高生长速率和活性。
[0020] 与传统的通过饲养层细胞提高杂交瘤细胞数量的方法相比，本发明采用体外培养 能够表达IL-6的真核细胞来制备添加剂，无需杀害小鼠即可获得能够有效提高杂交瘤细胞 数量的添加剂，并且实验证明，本发明的添加剂提高杂交瘤细胞数量的效果可以达到饲养 层细胞的2倍以上，不仅节约了抗体制备的成本和时间，还保护了动物。与商品化的杂交瘤 添加物相比，本发明的添加剂制备方法简单易行，所使用的试剂和耗材成本低，大大降低了 经济成本和人力成本，尤其适用于大规模的抗体生产。
【附图说明】
[0021 ]图1.IL-6在细胞培养上清和裂解上清中的表达情况。
【具体实施方式】
[0022]下面参考具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅作为解释 和说明，而不能理解为对本发明的限制。
[0023]本发明使用的生物材料(微生物，Flp-In-293细胞，表达载体)和试剂均可商购获 得，本单位也有保存，可保证自申请日起向公众发放用于验证试验。
[0024]Flp-In-293 属于CH0 细胞系。
[0025]实施例1、用于提高杂交瘤克隆数量的添加剂的制备 [0026] 1、引物的设计与合成
[0027] 根据已知的Musmusculusinterleukin6(116)序列（GeNBank号GenelD: 16193)， 用JavaCodonAdaptationTool软件优化序列，得到序列IL_6*(如SEQIDNO. :1所示）。该 序列由上海生工合成并克隆到pGH质粒上，得到pGH-IL-6*质粒。其PCR引物为：
[0028] 上游引物11-卩：5'-八八66丁八〇^七区&&&1:1：(3(^区1：(^区(31：0区-3'，
[0029] 下游引物IL-R: 5 ' -TATCTAGAttaggtctgacgggtag-3 '
[0030] 上游引物和下游引物分别带有Kpnl，Xba頂每切位点。该引物由上海生工合成。
[0031] 2、构建真核表达载体pcDNA5/FRT-IL6
[0032] 以pGH-IL-6*质粒为模板，PCR扩增得到IL-6*序列，用KpnI，XbaI限制性内切酶对 该序列进行双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，同时用Kpnl，XbaI双酶切真核表达载 体pcDNA5/FRT(购自Invitrogen公司）。将目的片段与载体在16°C连接过夜，42°C热激转化 感受态细胞E.coliDH5a，涂布于Amp平板上培养。挑取单菌落，使用载体通用引物M13R/ Ml3F(Ml3F:GTAAAACGACGGCCAGTMl3R:AACAGCTATGACCATG)进行单菌落PCR鉴定，获得阳性 克隆，其PCR产物的大小与预期相符合；同时提取该阳性克隆的质粒，用Kpnl，XbaI进行双酶 切，酶切产物的大小与预期相符合，由此获得真核表达载体，命名为PCDNA5/FRT-IL6。
[0033] 3、真核表达载体pcDNA5/FRT-IL6转染Flp-In-293细胞
[0034] 转染前24h，对Flp-In-293细胞（购自Invitrogen公司）进行消化并接种于6孔板 中，5X105细胞/孔。转染前将Opti-MEM培养基、无血无抗DMEM培养基于37°C水浴预热，将质 粒、Lipofectamine(购自Invitrogen公司）进行冰浴；加入lyg重组质粒pcDNA5/FRT_IL6至 含有Opt