一种高效生物絮凝剂产生菌的选育方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种高效生物絮凝剂产生菌的选育方法。
【背景技术】
[0002]现有的絮凝剂产生菌，很多是从污水处理厂的活性污泥中分离、纯化筛选出。但现 有菌株絮凝率较低，有待通过人工选育进一步提高絮凝效果。
【发明内容】
[0003]本发明针对上述缺陷，目的在于提供一种能大幅度提尚广生菌絮凝率的一种尚效 生物絮凝剂产生菌的选育方法。 为此本发明采用的技术方案是:本发明按照以下步骤进行： 1) 从冷藏保存的种子斜面上，取一环枯草芽孢杆菌，接入装有发酵培养基的三角瓶中， 于28-30°C、180-200r/min下震荡培养30-32h，离心分离菌体，用生理盐水制成106个/mL 孢子的细胞悬浮液备用； 2) 紫外线诱变： 在无菌条件下，取上述备用的细胞悬浮液，均匀涂布于装有筛选培养基的培养皿表面， 将培养皿置于紫外灯下处避光照射，培养皿用黑纸包好，置于28-30°C恒温、避光培养;3-4d 后挑取生状态好的单菌落，接种到发酵培养基中，于28-30°C、180 -200r/min震荡培养30-32h； 所述发酵培养基：葡萄糖8_10g，K2HP〇4 l_3g，KH2 P〇41-2g，NaCl0.1-0.3g，尿素 0.4-0.6g，酵母膏0.5-0.7g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5,各物料可同比例放大或缩小； 所述筛选培养基： 葡萄糖6_8g，邻苯二甲酸二异辛酯8-11，腿2?041-2 8，腿2?〇4〇.5-18，恥(：10.1-0.3g，0.5g，酵母膏0.6-0.8g，琼脂 18-20g，硫酸锰0.001-0.003g，蒸馏水980 -1000mL，pH 7.0-7.5，各物料可同比例放大或缩小。 优选的： 1) 从冷藏保存的种子斜面上，取一环枯草芽孢杆菌，接入200 -210mL装有发酵培养基 的三角瓶中，于28-30°C、180-200r/min下震荡培养30-32h，离心分离菌体，用生理盐水制 成106个/mL孢子的细胞悬浮液备用。 2) 紫外线诱变： 在无菌条件下，取上述备用的细胞悬浮液0.1-0.2mL，均勾涂布于装有筛选培养基的 培养皿表面，将培养皿置于20w紫外灯下28-30cm处避光照射40，80、120秒，培养皿用黑纸 包好，置于28-30°C恒温、避光培养，每处理作3个平行试验。3-4d后挑取生状态好的单菌落， 接种到发酵培养基中，于28-30°C、180 -200r/min震荡培养30-32h，分别取样测发酵液的絮 凝率。并以未经紫外照射的枯草芽孢杆菌接种的发酵培养液作对照。 2)步骤后进行以下选育： 化学诱变方法： 取紫外诱变菌株一环，接种于发酵培养基，于30-31°C、120-140r/min下震荡培养30-32h，离心收集细胞，用无菌生理盐水和磷酸钾缓冲溶液各洗涤1-2次后，将洗好的细胞悬浮 于含有10-11g/L5-溴尿嘧啶(BU)的磷酸钾溶液中，28-30°C、120 -140r/min震荡培养30-32min;取10-12mL处理后的悬液用0.16-0.18mol/L硫代硫酸钠溶液稀释，离心收集细胞， 用磷酸钾缓冲溶液和无菌水各洗涤1次后，匀涂在筛选培养基平板上，28-30°C恒温培养，从 平板上挑取较大单菌落，接种于发酵培养基中，于28-30°C、120-140r/min震荡培养30-32h〇 本发明的优点是：1)本发明絮凝菌株采用紫外线诱变和化学诱变相结合的方法，选育 出突变菌株，遗传稳定性良好，其絮凝率达到96.8%，比原菌株提高了 25.1%。2)选育出的菌 株絮凝活性优良，处理污水投加量少，排出沉淀物较聚合氯化铝少，且可生物降解，或作为 动物饲料的添加剂加以利用，可避免对环境造成二次污染。且处理水样的各项指标均优于 目前广泛应用的聚合氯化铝。
【附图说明】
[0004]图1为紫外线诱导后发酵液絮凝示意图。 图2为发酵液投入量对絮凝效果影响图。
【具体实施方式】
[0005]下面对本发明做出具体的说明： 1试验方法： 1.1培养基： 1.1.1发酵培养基： 葡萄糖8-10g，K2HP〇4l_3g，KH2P〇4 1-2g，NaCl0· 1-0.3g，尿素0.4-0.6g，酵母膏 0.5-0.7g，蒸馏水 1000mL，pH7.0-7.5。 1.1.2筛选培养基： 葡萄糖6_8g，邻苯二甲酸二异辛酯8-11，腿2?〇4 1-2 8，腿2?〇4〇.5-18，恥(：10.1-0.3g，0.5g，酵母膏0.6-0.8g，琼脂 18-20g，硫酸锰0.001-0.003g，蒸馏水980 -1000mL，pH 7.0-7.5。 1.2种子培养 从冷藏保存的种子斜面上，取一环枯草芽孢杆菌，接入200 -210mL装有发酵培养基的 三角瓶中，于28-30°C、180-200r/min下震荡培养30-32h，离心分离菌体，用生理盐水制成 106个/mL孢子的细胞悬浮液备用。 1.3紫外线诱变 在无菌条件下，取上述备用的细胞悬浮液0.1-0.2mL，均勾涂布于装有筛选培养基的 培养皿表面，将培养皿置于20w紫外灯下28-30cm处避光照射40，80、120秒，培养皿用黑纸 包好，置于28-30°C恒温、避光培养，每处理作3个平行试验。3-4d后挑取生状态好的单菌落， 接种到发酵培养基中，于28-30°C、180 -200r/min震荡培养30-32h，分别取样测发酵液的絮 凝率。并以未经紫外照射的接种的发酵培养液作对照。 絮凝率测定方法： 在150mL量筒中加入100 -llOmL高岭土(4g/L)悬浊液，加1-2%CaCl2溶液4 -4.3mL和 44-4.2mL培养液，200-220r/min快速搅拌2 -3min，100-110r/min搅拌5-6min，静置 15-17min后，取上清液测定550nm处吸光度。同时以未接菌种的液体培养基代替培养液作 对照，计算絮凝率。 絮凝率=(A-B)/AX100% A对照上清液的吸光度，B样品上清液的吸光度。 1.4化学诱变方法 取紫外诱变菌株一环，接种于装有100 -110mL发酵培养基的三角瓶中，于30-31°C、 120-140r/min下震荡培养30-32h，离心收集细胞，用无菌生理盐水和0.lmol/L磷酸钾缓冲 溶液(pH7.0)各洗涤1-2次后，将洗好的细胞悬浮于含有10-11g/L5-溴尿嘧啶(BU)的磷 酸钾溶液(pH7.0)中，28-30°C、120 -140r/min震荡培养30-32min;取10-12mL处理后的悬 液用0.16-0.18mol/L硫代硫酸钠溶液100mL稀释，离心收集细胞，用0.1mol/L磷酸钾缓冲 溶液和无菌水各洗涤1次后，取〇. 1-0.2mL匀涂在筛选培养基平板上，28-30°C恒温培养，从 平板上挑取较大单菌落，接种于发酵培养基中，于28-30°C、120-140r/min震荡培养30-32h，取样测发酵液的絮凝率，通过实验结果筛选出目标菌株。 1.5污水处理效果试验 把筛选出的菌株XN-3,接种到装有350mL发酵培养基的三角瓶中，于30-31°C、120-140r/min下震荡培养30-32h，收集发酵液用于污水处理实验。为了证明实验效果的真实性，本 效果试验委托河北省污水处理重点实验室一一河北桑沃特水处理有限责任公司进行的应 用实验。 取城市生活污水1000 -1100mL，维持温度23