一种提取生物气溶胶中微生物总dna的样品前处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及空气气溶胶中微生物研究领域，具体地说，涉及一种提取生物气溶胶 中微生物总DNA的样品前处理方法。
【背景技术】
[0002] 生物气溶胶是具有生命的气溶胶粒子（包括细菌、真菌、病毒等微生物粒子）和活 性粒子（花粉、孢子等）以及由有生命活性的机体所释放到空气中的质粒等。因为空气中 生物气溶胶浓度低，对其研究首先需要对空气中生物粒子进行收集，使空气微生物得以富 集。目前收集方法主要有三种：（1)利用撞击式采样器使生物气溶胶撞击到选择性培养基 表面，待目标空气微生物生长后用于后续分析；（2)利用采样器将空气中生物气溶胶吸收 至缓冲液中，用滤膜过滤缓冲液，使微生物吸附于滤膜表面，用于后续分析；(3)利用仪器 将空气中的生物气溶胶直接过滤到滤膜表面。第（1)种方法主要用于收集生物气溶胶中可 培养微生物，由于空气中可培养微生物只占全部微生物的不到百分之十，所以目前大多研 究者都采用后两种样品采集方式对空气中的全部微生物进行采集，并利用分子生物学方法 对滤膜收集的空气微生物进行分析，从而更加全面的反应实际空气微生物的情况。
[0003] 目前，对于空气中全部微生物研究的瓶颈在于生物气溶胶样品总DNA的有效提 取。现有技术中利用滤膜收集空气微生物，DNA提取的前处理方法通常有以下几种：一种是 直接将吸附生物气溶胶的滤膜作为样品，对整个膜进行提取DNA的操作；另一种是先以缓 冲液作为介质将膜上的空气微生物脱离下来，将其过滤至面积更小的膜上，在对面积较小 的膜进行提取DNA的操作。然而，第一种方法因为滤膜面积较大，在DNA提取的过程中，导 致DNA损失量较大；第二种方法虽然在提取过程中损失较小，可是脱膜过程中使用的缓冲 液，如0. 1%TritonX-100缓冲液或者含有0. 03%吐温-20的磷酸盐缓冲液，含有有害人 体健康的有机物，而且缓冲液配置过程复杂、步骤繁琐。因此，急需一种对人体无毒无害且 操作简单的DNA提取的前处理方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种操作简单、对人体无毒害，且能够有效提高DNA提取 量的生物气溶胶中微生物总DNA的样品前处理方法。
[0005] 本发明提供的一种提取生物气溶胶中微生物总DNA的样品前处理方法，包括以下 步骤：
[0006] (1)样品收集：采样器收集空气环境中生物气溶胶中的微生物，将其过滤至纤维 滤膜上；
[0007] (2)样品脱膜处理：将吸附生物气溶胶的纤维滤膜平整铺放在无菌容器中，颗粒 吸收面朝向容器上方，加入无菌玻璃珠和无菌生理盐水，于恒温摇床上振荡处理；
[0008] (3)样品过膜处理：将步骤（2)处理之后的洗脱液，采用微孔醋酸纤维滤膜过滤， 再将微孔醋酸纤维滤膜放入无菌容器中，在振荡器上振荡处理，处理后的固体物用于总DNA 的提取。
[0009] 本发明的方法中，步骤（1)中采样器为TSP空气总颗粒采样器。
[0010] 米样时间为24_48h。优选米样时间为24h。
[0011] 其中，步骤（1)的纤维滤膜为石英纤维滤膜或玻璃纤维滤膜，直径为48-90_。优 选石英纤维滤膜，优选直径为90mm。
[0012] 步骤（1)样品采集结束后，可将生物气溶胶的滤膜保存在-80°C冰箱也可直接用 于后续操作。
[0013] 本发明方法中，步骤（2)加入的无菌玻璃珠直径为4_6mm，数量在40-60个之间。
[0014] 其中，步骤（2)加入的无菌生理盐水浓度为0.8%-0. 9%，加入量以完全浸润纤维 滤膜并有剩余为准。
[0015] 其中，步骤（2)恒温摇床工作条件为100_120rpm处理10-12h。
[0016] 本发明方法中，步骤⑶微孔醋酸纤维滤膜直径为10_25mm，孔径为 0. 22-0. 45μm。优选微孔醋酸纤维滤膜直径为25mm，孔径为0. 22μm。
[0017] 其中，步骤（3)的振荡处理条件为6· 0-8.Om/s，处理40-60s。
[0018] 本发明在对已有前处理方法的基础上，进行改进：利用滤膜收集空气微生物，以生 理盐水取代了复杂的缓冲溶液和有机试剂作为缓冲液，在摇床振荡作用下，并加之玻璃珠 碰撞，使微生物能够充分的从滤膜上脱离下来，提高脱膜效率，简化了操作步骤，提高实验 的安全性。在将脱膜液过滤至面积更小的膜上，本发明的一个实施例中选用直径为25mm的 滤膜过滤，使微生物浓缩于较小面积膜表面（1.96cm2)便于后续振荡处理，有助于膜表面 附着细胞壁较厚的微生物充分破壁，如革兰氏阳性菌，提高后续DNA提取的效率。本发明方 法不仅操作简单、对人体无毒害，而且能够有效提高DNA提取量。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020] 实施例1
[0021] 样品采集：在北京市农林科学院内采集空气生物气溶胶样品。采样仪器为空气总 颗粒物采集器（青岛崂应环保科技有限公司），采样时间为48h。将采样后的微生物过滤至 直径为90mm的石英纤维滤膜上，然后将石英纤维滤膜分成3份。
[0022] 第1份，按照本申请的方法，将吸附生物气溶胶的纤维滤膜平整沿着管壁铺放在 50ml无菌离心管中，未吸附微生物的那一面滤膜贴着离心管壁，颗粒吸收面朝上，确保玻璃 珠直接接触吸收面。加入直径为5mm的无菌玻璃珠40个和0. 8%的无菌生理盐水，无菌生 理盐水的加入量以完全浸润纤维滤膜并有剩余为准。将离心管固定在恒温摇床上，lOOrpm 处理12h。在操作过程中需要确保玻璃珠在摇床转动的过程中与空气微生物吸附面充分接 触。于恒温摇床上振荡处理；采用面积更小的滤膜（直径为25mm，孔径为0. 22μm的微孔 醋酸纤维滤膜），对上述处理之后的洗脱液进行过滤。然后将上述微孔滤膜，放入1. 5ml的 离心管中，在振荡器上以6.Om/s的速度，处理50s。将处理后的固体物采用DNA提取试剂盒 (Μ0-ΒΙ0PowerSoi丨Φ) DNA Isolation Kit)进行DNA提取。
[0023] 第2份，不经过处理，直接对吸附生物气溶胶的滤膜进行