一种裂解组合物及其用途、试剂盒、利用该裂解组合物制备核酸的方法、核酸分析的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种裂解组合物及其用途、试剂盒、利用该裂 解组合物制备核酸的方法、核酸分析的方法。
【背景技术】
[0002] 荧光定量PCR(qPCR)，是一种基于多聚酶链反应PCR(PolymeraseChain Reaction)的在许多方面改进的DNA扩增技术。定量PCR在thermalcycler仪器中进行时 仪器通过发射特殊波长的光束照亮每一个DNA样本以及探测激发突光团（fluorophonre) 发出的荧光。qPCR需要使用荧光探针或荧光引物，目标DNA在即时扩增时其变化的数量可 以通过一台实时PCR仪器同时进行监测。另外，qPCR还可以同时扩增一个或多个目标DNA 序列。
[0003]qPCR(quantitativePCR)在对DNA模板上要求严格，一般需要从生物样品中提取 纯净DNA才能进行。常规繁琐的提取DNA主要方法如下：（1)经典常规的苯酚氯仿（phenol/ chloroformDNAextraction)抽提法时间长、抽提步骤繁琐且毒性大，不能够用于高通量 实验。此外苯酚氯仿化学试剂已经被证明是实验室重要的致癌物质，长期接触将对操作人 员的身体造成不可逆的伤害，对健康与安全形成较大的威胁；（2)离子交换纯化柱法（Spin column)，用silica膜收集DNA，步骤繁琐，多次使用离心机和换离心管，实验过程中DNA易 丢失，提取量少，且价格昂贵，并且还产生较多不易消除的废料。上述2个方法都不利于高 通量；（3)磁珠法（Magnetbeads，又称玻璃珠分离法）：用磁珠提纯DNA方法步骤相对简 便，较少换离心管，但也多个步骤，并且需要高价值昂贵自动化工作站特殊设备。，磁珠提纯 DNA方法所采用的自动化工作站就是非常典型的高价值设备。此外，磁珠分离DNA法虽然较 少换离心管，但也多个步骤，并且需要昂贵的特殊设备。这些现有技术需要多次更换离心管 或多次清洗-收集DNA，容易导致样品交叉污染。直接进行实时PCR而不需要提取DNA方法 的报道非常有限的。因此，提供一种无需经过提纯核酸、能够直接用于核酸分析的裂解组合 物，试剂盒、用该裂解组合物制备核酸的方法、以及核酸分析的方法具有现实意义。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供一种裂解组合物及其用途、试剂盒、利用该裂解组合物制备 核酸的方法以及核酸分析的方法。该裂解组合物可以快速简捷制取核酸直接用于核酸分 析。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种裂解组合物，包括A或B或两者的组合物；
[0007]所述A选自NaOH，Κ0Η或者Ca(0H) 2 ;所述B为PEG。
[0008]PEG，聚乙二醇。也称为聚（环氧乙烯）（ΡΕ0)或聚氧乙烯（Ρ0Ε)，是指环氧乙烷的 寡聚物或聚合物。这三个名称现今一般为同义词，但历史上聚乙二醇往往是指分子质量低 于20,OOOg/mol的低聚物和聚合物，PEO是指分子量超过20, 000的聚合物，POE则可指任何 分子质量的聚合物。PE0以及P0E根据分子量的不同，可为液体或低熔点液体。由于链长的 影响，不同分子量的聚乙二醇往往有不同的物理性质（如黏度）及不同的应用。作为优选， PEG的分子量为100~2000。
[0009] 本发明的一些实施例中，裂解组合物中所述A的浓度为0. 1~200mmol/L，所述B 的浓度为1~200mg/mL。
[0010] 本发明的一些实施例中，裂解组合物还包括反应终止物。在本发明的一些实施例 中，反应终止物可以为终止裂解反应的物质。作为优选，所述反应终止物为TurboBuffer。 任何可以终止生物样品裂解反应的试剂均可以应用，本发明在此不作限定。
[0011] 本发明的一些实施例中，当所述裂解组合物中包括A和B时，所述A与所述B的摩 尔比为 〇· 1 ~200 :0· 45 ~1. 05。
[0012] 本发明还提供了上述裂解组合物用于裂解生物样品制备核酸的应用。
[0013] 在本发明的一些实施例中，所述生物样品与所述裂解组合物的质量体积比为：1: 1 ~1 :10 (以g/mL计）。
[0014] 本发明的一些实施例中，所述生物样品包括真核生物或原核生物。
[0015] 本发明的一些实施例中，所述真核生物包括动物、植物、微生物。
[0016] 本发明的一些实施例中，所述动物包括动物液体组织、动物固体组织。
[0017] 本发明的一些实施例中，所述动物液体组织包括唾液、尿液、血液、胃液、胸积水、 肺部积水、腮腺细胞、淋巴液、骨髓液、奶液、眼泪、精液、脊髓液，脑髓，羊水，关节液或鼻液 中的一种或两者以上的组合物。
[0018] 本发明的一些实施例中，所述动物固体组织包括肠组织、喉咙组织、肿瘤组织、细 胞系、肺部组织肝组织、胃组织、肾组织、胰腺组织、前列腺组织、子宫组织、卵巢组织、胆囊 组织、心组织、皮组织、脑或粪便中的一种或两者以上的混合物。
[0019] 本发明中，制备得到的所述核酸不需提纯直接用于核酸分析。
[0020] 本发明的一些实施例中，所述核酸分析包括扩增反应、酶反应、突变体位点检测或 SNPs检测。
[0021] 本发明的一些实施例中，所述核酸分析为PCR、连接酶链反应、缺口 -LCR、修复链 反应、转录介导的扩增、自主序列复制、目标多核苷酸系列的选择性扩增、共有序列引物聚 合酶链反应、随机引物聚合酶链反应、基于核酸序列的扩增、链置换扩增、环介导等温扩增、 DNA甲基化反应、逆转录反应、DNA连接反应、核酸酶介导反应。
[0022] 本发明的另一些实施例中，所述PCR反应包括常规PCR、RT-PCR(RNA)、qPCR。
[0023] 本发明的另一些实施例中，所述逆转录反应包括普通RNA逆转录、RNAi逆转录、 SiRNA、LncRNA或miRNA逆转录。
[0024] 本发明还提供了一种试剂盒，包括上文所述的裂解组合物。
[0025] 本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中当所述裂解组合物中包括A和B 时，所述A与所述B的摩尔比为0. 1~200 :0. 45~1. 05。
[0026] 本发明还提供了上述试剂盒用于裂解生物样品制备核酸的应用。
[0027] 在本发明的一些实施例中，所述生物样品与所述试剂盒中的裂解组合物的质量体 积比为：1 :1~1 :1〇 (以g/mL计）。
[0028] 本发明的一些实施例中，利用上述试剂盒裂解生物样品制备的所述核酸不需提纯 直接即可用于核酸分析。
[0029] 本发明的一些实施例中，所述核酸分析包括酶反应、扩增反应、突变体位点检测或 SNPs检测。
[0030] 本发明的一些实施例中，所述核酸分析为PCR、连接酶链反应、缺口 -LCR、修复链 反应、转录介导的扩增、自主序列复制、目标多核苷酸系列的选择性扩增、共有序列引物聚 合酶链反应、随机引物聚合酶链反应、基于核酸序列的扩增、链置换扩增、环介导等温扩增、 DNA甲基化反应、逆转录反应、DNA连接反应、核酸酶介导反应。
[0031] 本发明的另一些实施例中，所述PCR反应包括常规PCR、RT-PCR、（RNA)、qPCR。
[0032] 本发明的另一些实施例中，所述逆转录反应包括普通RNA逆转录、RNAi逆转录或 miRNA逆转录。
[0033] 本发明还提供了一种制备核酸的方法，利用上文所述的裂解组合物裂解生物样 品，制得核酸。
[0034] 本发明还提供了一种核酸分析的方法，所述核酸由上文所述的裂解组合物裂解生 物样品制得，不需提纯直接用于核酸分析。
[0035] 具体的，本发明使用裂解组合物，从组织裂解后到核酸分析流程如下：
[0036] 1，组织、细胞等生物样品中加入本发明提供的裂解组合物，所述生物样品与所述 裂解组合物的质量体积比为：1 :1~1 :1〇(以g/mL计）
[0037] 2,高温（30°C~90°C)，处理10分钟~8小时；
[0038] 3,裂解后加Turbobuffer(上海鸿慧健康科技有限公司），终止反应；
[0039] 4,离心后进行核酸分析。
[0040] 本发明用人类及其他生物多种组织和细胞经过一种新的裂解组合物，使核酸从生 物样品中得以高效释放并免提核酸，仅在一个离心管中2个步骤完成而直接为核酸分析提 供模板，以代替常规必须先裂解细胞提取模板核酸才能作核酸分析的方法。
[0041] 具体的，本发明使用裂解组合物，从组织裂解后到qPCR步骤反应流程如下：
[0042] 1、组织、细胞等生物样品中加入本发明提供的裂解组合物，所述生物样品与所述 裂解组合物的质量体积比为：1 :1~1 :1〇(以g/mL计）；
[0043] 2、高温（30°C~90°C)，处理10分钟~8小时；
[0044] 3、裂解后加Turbobuffer(上海鸿慧健康科技有限公司），终止反应；
[0045] 4、离心后进行qPCR。
[0046] 在本发明的一些实施例中，用常规方法制备的核酸作为对照组，以本发明提供的 上述裂解组合物制备的核酸作为实验组，发现本发明提供的上述裂解组合物制备的核酸可 以不经提取、即可直接为核酸分析提供模板，效果与对照组无显著差异（P> 〇. 05)。
[0047] 本发明提供一种裂解组合物及其用途、试剂盒、利用该裂解组合物制备核酸的方 法、核酸分析的方法。该裂解组合物可以快速简捷制取核酸直接用于核酸分析。
[0048] 本发明提供一种新的裂解组合物，人类及其他生物多种组织和细胞经该裂解组 合物裂解，使核酸从细胞中得以高效释放并免提核酸，仅在一个离心管中2个步骤完成而 直接为核酸分析提供模板，以代替常规必须先裂解细胞提取模板核酸才能作核酸分析的方 法。
[0049] 本发明采取极简易的仅一步裂解不用纯化核酸的程序，明显节省时间、减少人工 和耗材费用、更重要的是减少样品交叉污染，以及样品对操作人员的感染，不损失核酸样品 (尤其对低拷贝、痕量的特殊样品，如早期疾病细胞组织）。其技术方法具有明显的快速便 捷，有利于高通量和高灵敏度的生物样品分析的特点。此外，本方法避免使用有毒致癌物质 有利于健康和绿色环保，步骤少，流程简单，耗时短，简便，制备样品一管不换（减少污染）， 适合高通量，高效，废物少，环保好（无致癌物、少耗料、少废料）。不损失核酸有利于痕量样 品检测。
【附图说明】
[0050] 图1示本发明提供的裂解组合物制备核酸与常规方法的比较；
[0051] 图2示实时荧光定量PCR(qPCR)方法作BRAF基因突变分子检测扩增图；其中，组 织样本1为手术肠息肉组织（取自于贵州省中医院附属第一医院）、组织样本2为手术食管 癌组织（取自于苏州大学附属第一医院）、#3为胸积水组织块（取自福建南京军区福州总 医院）、#4和#5为正常独立两个人，NTC(用水作无模板负对照