一种dna亚硫酸盐转化及纯化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸甲基化转化及纯化领域，涉及一种DNA在恒温条件、变性剂及DNA 保护试剂下，使用亚硫酸盐转化DNA，并使用纯化试剂进行转化DNA纯化，并应用于各类分子 生物学研究。
【背景技术】
[0002] 甲基化是指从活性甲基化合物（如S-腺苷基甲硫氨酸）上将甲基催化转移到其他 化合物的过程。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化，本发明所涉及为DNA甲 基化。
[0003] DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷 甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。DNA甲基化 一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，S卩DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位 点）。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG位 点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与 包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。1 %-2%的人类基因 组是CpG群，并且CpG甲基化与转录活性成反比。DNA甲基化是一种表观(epigenetic)修饰， 它在不改变DNA序列的情况下，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起 到重要的调控作用，并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来 的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。
[0004] 目前研究DNA甲基化的方法有很多种，但都需要经过DNA亚硫酸盐转化后，再运用 各种检测手段进行相关研究。DNA在亚硫酸盐转化过程中会使未甲基化的胞嘧啶转化为尿 嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。因此，可以结合NGS、MSP、HRM等方法来检测分析DNA序 列哪些位点发生甲基化。
[0005]亚硫酸盐转化的原理非常简单，目前的亚硫酸盐转化基本步骤分为:DNA的分离纯 化，氢氧化钠变性、亚硫酸盐变温转化及脱磺酸基和脱盐。但是亚硫酸盐转化的主要问题是 需要首先对需要转化的核酸进行氢氧化钠变性，而后进行长时间的转化及变温过程，且需 要氢氧化钠溶液进行脱磺酸基。在此过程中，会导致DNA的严重降解及片段化。除了DNA降解 问题，亚硫酸盐转化后的DNA纯化方法没有较好的解决，目前商品化的试剂盒基本都是采用 离心柱方法进行产物纯化，并且需要carrierRNA，同时需要多步洗涤过程，步骤过多而造 成DNA损耗高、提取效率降低，而且此方法需要离心机，难于实现自动化操作且纯化效率低、 操作繁琐、产率低。
[0006]因此，基于目前表观遗传学的快速发展，以及目前的亚硫酸盐转化方法及纯化方 法的一些问题，本发明对转化及纯化方法进行了优化改进，使DNA转化能够在70-90度范围 进行转化45-90min，并采用磁珠法对转化DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量及高纯 度的DNA，并有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作，用于后续分子生物学研究，尤其 临床分子诊断。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方 法，该方法能在恒温条件下（70-90°C)、同时在变性剂及DNA保护剂存在下进行亚硫酸盐转 化并对转化DNA进行纯化，并结合简便的磁珠法纯化方法，能够快速得到高转化率、高质量、 高纯度的DNA，本发明的方法有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作。
[0008] 本发明涉及的DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，包括如下步骤：
[0009] (1)在离心管中加入20-60ul的待处理DNA;
[0010] (2)加入85-100ul转化溶液，再加入15-35ul保护溶液，混匀；
[0011] (3)将离心管置于70-90°C恒温金属浴中45-90min;
[0012] (4)冷却至室温，向其中加入300-600ul结合液及5-20ul磁珠溶液，混匀，室温放置 l〇-20min；
[0013] (5)将离心管置于磁力架上2-5min，待磁珠分离后，弃去上清液；
[0014] (6)加入0.5-lml洗涤液，充分混匀磁珠，然后置于磁力架上2-5min，待磁珠分离 后，弃去上清液；
[0015] (7)在磁力架上静置l-5min，弃去上清液；
[0016] (8)再加入40-100ul洗脱液，充分混匀后，20-65°C静置5-10min;
[0017] (9)再将离心管置于磁力架上l-2min，待磁珠分离后，转移上清液至一新的无 DNase与RNase酶离心管中，-20度保存备用。
[0018] 上述技术方案中，所述的转化溶液为:含1-3MA组分和10-800mMB组分的水溶液， pH5.0-5.5，其中A组分为重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中至少一种，B 组分为尿素、甲酰胺、、二甘醇二甲醚、异硫氰酸胍中的至少一种；
[0019] 所述的保护溶液为:含50-700mMC组分和10-200mMD组分的水溶液，pH5.0-6.0， 其中C组分为氢醌、三烯丙基异氰脲酸酯、水溶性维生素C、四乙烯五胺五盐酸盐中的至少一 种，D组分为重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中的一种；
[0020] 所述的结合液为:含0.5-6ME组分、10-500mMF组分和体积浓度为10-50%G组分 的水溶液，pH5-7,其中E组分为异硫氰酸胍、盐酸胍、高氯酸钠、碘化钠中至少一种，F组分 为Tris-HCl和HEPES中的至少一种，G组分为异丙醇、无水乙醇中至少一种；
[0021] 所述的洗涤液为:含0.5-3MΗ组分和体积浓度为10-70%1组分的水溶液，pH5-7， 其中Η组分为异硫氰酸胍、盐酸胍、高氯酸钠中至少一种，I组分为异丙醇和无水乙醇中至少 一种；
[0022] 所述的洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水或tris缓冲液或ΤΕ缓冲液;所述的tris缓冲液为10mM的tris-HCl，pH7·5-8·5，所述的TE缓冲液中含10mM的tris-HCl和lmM的EDTA， pH7·5-8·5〇
[0023] 所述的磁珠溶液为含浓度为50mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液，具体为超顺四氧化 三铁或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基或羧基的二氧化硅包被。
[0024] 本发明涉及的亚硫酸盐转化及纯化的方法，其可应用于脱氧核糖核酸转化及后续 纯化，所纯化的转化DNA可用于各类分子生物学检测，尤其为临床分子诊断。
[0025]本发明的方法具有如下优势：
[0026] 1、本发明涉及的甲基化转化试剂，不同于现有的转化方法，不需要对核酸进行前 期的氢氧化钠变性处理，而且能在恒温条件下高效进行变性、转化且不降解及片段化DNA， 整个转化时间只需要45-90min;同时可以使用恒温金属浴进行相关的转化实验，而不同于 市面上商品化试剂需要价格昂贵的PCR仪进行变温转化，转化时间短、仪器设备简单，操作 更简便。
[0027] 2、本发明涉及的磁珠法纯化试剂，适用于甲基化核酸转化后的核酸纯化，利用高 盐低pH值进行核酸的分离纯化，再通过低盐高pH值进行洗脱，具有高纯度、高回收效率的特 点，并且在整个纯化过程中不使用目前市场上均采用的氢氧化钠进行去磺化步骤，操作更 简便，更能节省整个实验操作时间。而且整个纯化过程也不需要carrierRNA，且能在常温 下进行纯化操作，无需任何高温孵育，同时结合一种洗涤液，只进行一次洗涤过程得到高纯 度的核酸，最后的洗脱也可以在常温下进行洗脱;具有操作简便、提高提取效率和提取纯度 的优点。
[0028] 3、本发明涉及的DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，将核酸上游的恒温转化及其下 游的磁珠分离纯化有效结合起来，有利于甲基化研究的全自动化和标准化操作；
【附图说明】
[0029]图1为采用本发明方法与Qiagen商品化试剂盒方法来转化及纯化甲基化人基因组DNA的实时荧光PCR检测图；
[0030] 图2为采用本发明方法与Qiagen商品化试剂盒方法来转化及纯化未甲基化基因组 DNA的实时荧光PCR检测图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图对本发明做进一步说明，实施例中所涉及的百分含量均指体积浓 度。
[0032] 实施例1不同转化温度的对比
[0033]甲基化人基因组的获取:采用QIAGEN商品化血液人基因组提取试剂盒提取人基因 组DNA，然后使用NEB公司的SssI甲基化转移酶进行甲基化处理，具体操作按厂家说明书进 行，甲基化处理结束后使用天根的PCR产物纯化试剂盒对甲基化处理的DNA进行纯化，纯化 后的DNA置于-20度冰箱备用。
[0034]本发明的亚硫酸盐转化及纯化具体实施步骤：
[0035] 1、在0.2ml离心管中加入20ul的待处理DNA(甲基化DNA或未甲基化DNA)，设置3份。 [0036] 2、每份分别加入85ul转化溶液，再加入35ul保护溶液，混匀。
[0037] 3、将3份离心管分别置于70°C、80°C、90°C恒温金属浴中60min。
[0038] 4、冷却至室温；
[0039] 5、将转化后的DNA分别转移至1.5ml离心管中，再分别加入300ul结合液、10ul磁珠 溶液，混匀，室温放置lOmin;
[0040] 6、将离心管置于磁力架上2min，待磁珠分离后，弃去上清液；
[00411 7、加入lml洗涤液，充分混匀磁珠，然后置于磁力架上2min，待磁珠分离后，弃去上 清液；
[0042] 8、在磁力架上静置lmin，弃去上清液；
[0043] 9、加入60ul洗脱液，充分混勾后，置于室温5min;
[0044] 10、再将离心管置于磁力架上lmin，待磁珠分离后，转移上清液至一新的无DNase 与RNase酶离心管中，-20度保存备用；
[0045] 所述转化溶液为含1.5M重亚硫酸钠，1.5M亚硫酸氢钠，10mM甲酰胺的水溶液， pH5.0〇
[0046] 所述的保护溶液为含50mM氢醌，100mM三烯丙基异氰脲酸酯和20mM亚硫酸氢钠的 水溶液，PH5.0。
[0047] 所述结合液为含3.5M异硫氰酸胍，0.5M碘化钠，100mMTris-HCl，30%异丙醇的水 溶液，PH5.0。
[0048] 所述洗涤液为含2.5Μ盐酸胍，50 %无水乙醇的水溶液，ρΗ7.0。
[0049] 所述洗脱液为含10mMTris-HCl的水溶液，ρΗ8.5。
[0050] 三种不同温度转化方法得到的DNA(依次记为Α、Β、C)采用实时荧光PCR进行甲基化 检测，检测结果见表1。
[0051] 表 1
[0053]可以看出，在不同转化温度方法上，采用实时荧光PCR方法，使用MSP引物检测甲基 化情况，各组的ct值基本相当，所以可以验证本转化试剂在70-90度温度下进行转化，且转 化效率一致，，相对于传统的变温方法而言，本发明采用恒温的方法更简单，易操作，能使用 便宜、简便恒温仪器进行相关实验研究。
[0054] 实施例2不同纯化试剂纯化DNA效果对比
[0055]甲基化人基因组的获取：同实施例