水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子 标记及其专用引物。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。 稻痕病是由子囊菌(Magnaporthegrisea(Hebert)Barr)引起的广泛发生在世界各稻区的重 要病害之一，严重威胁着世界的粮食安全。目前主要通过化学防治和种植抗病品种来控制 稻瘟病。化学防治在一定程度上能减轻病害、减少产量损失，但是对环境造成污染，因而通 过选育抗病新品种来预防稻瘟病是最佳选择，但由于其病菌小种遗传的复杂性和致病性的 多样性，抗病新品种在推广3-5年后会丧失抗性。目前，抗稻瘟病分子标记辅助育种主要利 用与抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，大大提高了育种效率，但往往也存 在分子标记与抗病基因不连锁导致辅助选择失败的情况。而利用抗病基因序列建立与稻瘟 病抗病基因完全共分离的基因标签，则能让辅助选择理论上达到100%的准确性。
[0003] 抗稻瘟病基因Pi2是较为广谱的抗性基因，但目前尚未有基因内特异性标记开发 的应用报道。目前，跟踪稻瘟病基因Pi2的分子标记一般用紧密连锁的标记AP22,显性分子 标记1卞1(12或共显性分子标记1-?12等，距离？12均有一定距离，选择效率无法达到1()0%; 而且有些方法还需要进行酶切，方法复杂，成本较高。
【发明内容】
[0004] 针对以上技术问题，本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记 及其专用引物，使用方法简单有效，降低了育种成本，能快速地检测抗稻瘟病基因Pi2的特 异性功能标记，由于该标记位于Pi2基因簇内，选择效率理论上达到100%的准确性。
[0005]对此，本发明的技术方案为：
[0006] -种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物，所述水稻抗稻瘟病基 因P i 2的特异性分子标记的专用引物由P i 2DomR引物和P i 2DomF引物组成，所述P i 2DomR引物 为序列表SEQID N0:1核苷酸序列的引物;所述Pi2DomF引物为SEQID N0:2核苷酸序列的 引物;具体如下所示。
[0007] Pi2DomR：TCTCTCTTAgCTgATCCAAgTCA
[0008] Pi2DomF:gCAggAATCTCAgATggTgg。
[0009] 本发明还提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，包括以下步骤：
[0010 ] 步骤S1;提取水稻的基因组DNA;
[0011]步骤S2:以步骤S1的水稻的基因组DNA为模板，采用如上所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物对基因组进行PCR扩增，对扩增产物进行1.2%琼脂糖凝 胶电泳以区分是否为含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻，含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻DNA能扩 增出322b的条带，而不含Pi2抗病基因的水稻DNA模板扩增不出目的条带。
[0012]作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的反应体系为20ul的体系，包括：10 X 811打612.0111，(1抑130.4111，浓度为4111〇1/1的？120〇1111?引物和？120〇11^引物各1.0111，丁&9酶 0·2u 1，模板DNA2·0u 1，ddH2012·8u 1。
[0013] 作为本发明的进一步改进，所述PCR扩增的反应程序为:94°C预变性5min，94°C变 性30s，62°C退火30s，72°C延伸45s，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次，72°C最后一 步延伸lOmin。
[0014] 本发明还提供了如上所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物 在水稻育种中的应用。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0016] 第一，采用本发明的技术方案，能准确判断水稻育种材料中是否含有Pi2基因。以 往的标记判断都有假阳性存在。
[0017]第二，采用本发明的技术方案，PCR扩增后，1.2%凝胶电泳即可检测，使用方法简 单，降低了育种成本。
[0018]第三，采用本发明的技术方案，缩短育种周期，选择效率理论上达到100%的准确 性，实际应用中，检测一个含有Pi2的F2分离群体248个单株，抗性与基因型完全一致，选择 效率100%，可以在水稻的分子标记辅助育种中发挥重要作用。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明不同水稻材料的抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的凝胶电泳图。
[0020] 图中，Μ代表DNA Marker DL2000,从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、 750bp、500bp、250bp和100bp。
[0021]图2是本发明实施例2抗性调查样品部分水稻DNA样品的凝胶电泳图。
[0022]图3是本发明实施例3用M-Pi2扩增96个水稻DNA样品的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0024]实施例1
[0025] 以下实施例中所用的96个水稻品种如下表1所示，所选水稻品种来源于广西壮族 自治区农业科学院水稻研究所和广西壮族自治区农业科学院植物保护所所存样品。
[0026] -种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物，所述水稻抗稻瘟病基 因Pi2的特异性分子标记的专用引物由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物 为序列表SEQIDN0:1核苷酸序列的引物;所述Pi2DomF引物为SEQIDN0:2核苷酸序列的 引物。
[0027] 水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的具体方法和过程如下：
[0028] 步骤S1;分别提取96个水稻品种的基因组DNA;
[0029]步骤S2:分别以步骤S1的水稻的基因组DNA为模板，采用所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物对基因组进行PCR扩增，对扩增产物进行1.2%琼脂糖凝 胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察拍照，96个水稻品种的电泳图如图1所示。
[0030]所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物由Pi2DomR引物和 Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQIDN0:1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物为SEQIDN0:2核苷酸序列的引物;具体如下所示。
[0031] Pi2DomR：TCTCTCTTAgCTgATCCAAgTCA；
[0032] Pi2DomF：gCAggAATCTCAgATggTgg；
[0033]所述PCR扩增的反应体系为20ul的体系，包括：10XBuffer2 .Oul，dNTP0.4ul， ?120〇1^引物和？120〇11^引物浓度4111〇1丄-1各1.0111，丁&9酶0.2111，模板0财2.0111， ddH2012.8ul〇
[0034] 所述PCR扩增的反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延 伸45s，其中，变性、退火和延伸三个步骤循环35次，72°C最后一步延伸lOmin。
[0035] 表1 96个水稻品种表
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