一种特异性抑制ctgf基因表达的小干扰rna及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及一种特异性抑制CTGF基因表达的小 干扰RNA及其应用。
【背景技术】
[0002] RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是指是指在进化过程中高度保守的、由双 链RNA(double_strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，RNA分子通 过破坏特定的mRNA，以抑制某种基因表达的生物学过程。该技术具有以下几点优势：1高效 性;2特异性;3位置效应;4高稳定性;5可传播性;6浓度时间依赖性。由于使用RNAi技术可以 特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术迅速成为基因功能研究和基因治疗研究领 域最受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗 领域。
[0003] 恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM):是源自于黑色素细胞的一种恶性肿瘤， 好发于皮肤，恶性程度高，治疗难度大。虽然黑素瘤仅占全部皮肤肿瘤的4%，但却占皮肤肿 瘤死亡人数的80%，是皮肤肿瘤中死亡率最高的一种恶性肿瘤。美国国家癌症研究所(NCI) 的数据显示，在2003-2007年间，患病人数为每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估计有 68130个患者被诊断患有黑色素瘤，其中8700个患者将因此丧生（http:// www.cancer.gov/)。恶性黑色素瘤的发生率在全世界范围内正在不断地上升，包括以前发 病率低的地区，它已成为一种严重威胁人们健康的恶性疾病。在中国黑色素瘤患者有逐年 增高的趋势。北京市八城区统计资料显示，2000年MM发病率为0.2例/10万，到了2004年已达 1例/10万。根据中国临床肿瘤协会(CSC0)黑色素瘤专家委员会发表的《中国黑色素瘤诊治 指南（2011版）》，我国每年新发病例约2万例，已经成为了严重危及我国人民健康的疾病之 〇
[0004] 结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF)是一种新发现可 刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积生长因子，是高度保守CCN(CTGF、Cen〇/cyr61和Nov缩写） 多肽家族中成员。CTGF蛋白为肝素结合型，含349个氨基酸，富含半胱氨酸，其分子量约为36 ~38kD，可由成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌。成年哺乳动物心、脑、肾、肺、肝 胎盘中均有表达。人类CTGF基因定位于染色体6q23<a，包括5个外显子，4个内含子。起始位 点为ATG，其Y端包含三个ATTTA位点。CTGF蛋白38个保守半胱氨酸残基分成两个节段，其中 22个在N末端区，16个在C末端区，4个主要蛋白结构区为胰岛素样生长因子结合蛋白区、von Wille-brand因子C型重复、血小板反应蛋白（thrombospondin)I型重复以及生长因子半胱 氨酸群，这些区域都由独立外显因子编码。CTGF广泛表达于人类多种组织器官中，在病理情 况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病发生发展密切相关，如胶质瘤、胰腺癌、甲状 腺癌、乳腺癌，胃癌、硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等。CTGF拥有多种 生物学功能，可以调节肿瘤细胞增殖、分化、有丝分裂、粘附、凋亡、胞外基质产生、生长抑制 和多细胞类型的迀移，因而可以在发育、损伤愈合和疾病中发挥重要作用。同时该基因在黑 素瘤的恶化过程中起重要的驱动作用。下调CTGF的表达，可以有效抑制肿瘤细胞的迀移和 侵袭能力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够特异性抑制CTGF基因表达的小干扰RNA(siRNA) 及其应用。
[0006] 本发明根据RNAi发生原理，设计并合成了针对CTGF基因的小干扰RNA，其GC含量为 47.37%，且正义链和反义链的长度均为19nt。
[0007] 进一步地，本发明的小干扰RNA双连体分子的正义链和反义链序列分别为：
[0008] 正义链：5 ' -CGCUGUACUACAGGAAGAUdTdT-3 '，（SEQIDN0 · 1)
[0009] 反义链：5'-TdTdGCGACAUGAUGUCCUUCUA-3'（SEQIDN0.2)。
[0010] 本发明提供的上述小干扰RNA，能够特异性下调细胞或生物体中CTGF基因的表达 量。
[0011] 进一步地，本发明的小干扰RNA作用于CTGF基因的靶序列为：5'_ CGCTGTACTACAGGAAGAT-3'（SEQIDN0.3)。
[0012] 本发明提供一种表达载体，其包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码 本发明上述小干扰RNA的一个或多个核酸。
[0013] 一种含有上述小干扰RNA的药物属于本发明的保护范围。
[0014] 进一步地，所述的药物为抑制肿瘤的药物。所述的肿瘤为黑色素瘤、胶质瘤、胰腺 癌、甲状腺癌、乳腺癌，胃癌。
[0015] 进一步地，所述的药物为调节细胞或器官纤维化的药物。
[0016] -种可表达上述小干扰RNA的细胞系也属于本发明的保护范围。
[0017] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备调节细胞或生物体中的CTGF基因表达药物中 的用途。
[0018] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备抑制肿瘤细胞迀移和侵袭的药物中的用途。
[0019] 优选地，所述肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、胶质瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌，胃癌。
[0020] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备在调节细胞或器官纤维化药物中的应用。
[0021 ]本发明提供了上述小干扰RNA在制备治疗疾病的药物中的用途，所述的疾病为黑 色素瘤、胶质瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌，胃癌。
[0022]有效的靶向治疗是目前国内外不断寻找的辅助治疗方法，本发明提供的靶向针对CTGF基因的siRNA转染黑色素瘤细胞后，发现siRNA能够显著下调CTGF基因的表达，有效抑 制肿瘤细胞的迀移和侵袭能力，对于开发新的抗肿瘤基因药物和肿瘤药物的治疗效果具有 重要指导作用，可用于开发制备抗肿瘤药物，将会取得巨大的社会效益和经济价值。
【附图说明】
[0023] 图1为siRNA对A375细胞CTGF基因表达的敲低效果。其中1:未转染siRNA的A375细 胞;2:转染阴性对照序列的A375细胞;3:转染siRNA的A375细胞。
[0024]图2为A375细胞中CTGF基因mRNA敲低水平的电泳检测结果，其中泳道1:分子量标 记；泳道2 :转染siRNA的A375细胞；泳道3 :转染阴性对照序列的A375细胞；泳道4:未转染 siRNA的A375细胞。。
[0025] 图3为A375细胞CTGF蛋白敲低水平的Westernblot检测，其中泳道1:未转染siRNA的A375细胞;泳道2:转染阴性对照序列的A375细胞;泳道3:转染siRNA的A375细胞。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0027]若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028]实施例1特异性靶向CTGF基因的siRNA的设计合成及转染黑色素瘤细