一种特异性抑制twist1基因表达的小干扰rna及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及一种特异性抑制TWIST1基因表达的 小干扰RNA及其应用。
【背景技术】
[0002] RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是指是指在进化过程中高度保守的、由双 链RNA(double_strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，RNA分子通 过破坏特定的mRNA，以抑制某种基因表达的生物学过程。该技术具有以下几点优势：1高效 性;2特异性;3位置效应;4高稳定性;5可传播性;6浓度时间依赖性。由于使用RNAi技术可以 特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术迅速成为基因功能研究和基因治疗研究领域最 受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领 域。
[0003] 恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM):是源自于黑色素细胞的一种恶性肿瘤， 好发于皮肤，恶性程度高，治疗难度大。虽然黑素瘤仅占全部皮肤肿瘤的4%，但却占皮肤肿 瘤死亡人数的80%，是皮肤肿瘤中死亡率最高的一种恶性肿瘤。美国国家癌症研究所(NCI) 的数据显示，在2003-2007年间，患病人数为每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估计有 68130个患者被诊断患有黑色素瘤，其中8700个患者将因此丧生（http:// www.cancer.gov/)。恶性黑色素瘤的发生率在全世界范围内正在不断地上升，包括以前发 病率低的地区，它已成为一种严重威胁人们健康的恶性疾病。在中国黑色素瘤患者有逐年 增高的趋势。北京市八城区统计资料显示，2000年MM发病率为0.2例/10万，到了2004年已达 1例/10万。根据中国临床肿瘤协会(CSC0)黑色素瘤专家委员会发表的《中国黑色素瘤诊治 指南（2011版）》，我国每年新发病例约2万例，已经成为了严重危及我国人民健康的疾病之 〇
[0004]Twistl是属于b螺旋-环-螺旋家族的转录因子，位于7q21.2,包含2个外显子和1个 内含子。该转录因子的分子量约为SlkDadwistl的b螺旋-环-螺旋结构域在人类，小鼠，蛙， 果蝇等很多物种中高度保守。Twistl蛋白中1()9Q-T121是最主要的结构域，负责结合DNA。该基 因主要在中胚层来源的组织中表达。在人体正常组织中，Twistl在胎盘，心肌和骨骼肌等组 织中高表达，在胰腺，肾脏等组织中低表达，而在脑(外胚层来源），肺和肝（内胚层来源）的 组织中不表达。Twistl可以调控很多下游靶基因，通过这种方式，来参与控制各种各样的生 物学进程和信号通路件，例如FGF信号通路，SHH信号通路，以及TGF0信号通路等。
[0005]除了在正常组织中发挥作用，Twistl还与包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，胃癌，膀胱 癌，食道鳞状细胞癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤密切相关。在这些肿瘤中，Twistl可以在肿瘤 发生，发展和转移中扮演多种角色。特别是可以阻碍肿瘤诱导的细胞衰老和凋亡，增强肿瘤 干细胞群体，并且可以帮助癌细胞侵袭和转移，以及上皮-间叶转化(EMT)。其中EMT是肿瘤 细胞发生转移的第一个步骤。近来发现，乳腺癌、恶性黑色素瘤以及其他肿瘤中Twist过表 达可作为预后不良的一个指标，许多证据表明Twistl蛋白也参与调节细胞凋亡。在人类肿 瘤中Twistl活化可能具有非常重要的临床意义，Twistl很可能作为指导诊断、判断预后的 指标，并可作为肿瘤生物治疗的一个新靶点。
[0006] 下调TWIST1的表达，可以有效降低肿瘤抵抗衰老和凋亡的能力，抑制EMT的发生， 从而抑制肿瘤细胞的迀移和侵袭能力。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种能够特异性抑制TWIST1基因表达的小干扰RNA (siRNA)及其应用。
[0008] 本发明根据RNAi发生原理，设计并合成了针对TWIST1基因的小干扰RNA，其GC含量 为52.63%，且正义链和反义链的长度均为19nt。
[0009]进一步地，本发明的小干扰RNA双连体分子的正义链和反义链序列分别为：
[0010] 正义链：5 'CCGGAGACCUAGAUGUCAUdTdT-3 '，（SEQIDN0 · 1)
[0011] 反义链：5'-TdTdGGCCUCUGGAUCUACAGUA-3'（SEQIDN0.2)。
[0012] 本发明提供的上述小干扰RNA，能够特异性下调细胞或生物体中TWIST1基因的表 达量。
[0013] 进一步地，本发明的小干扰RNA作用于TWIST1基因的靶序列为：5'_ CCGGAGACCTAGATGTCAT-3'（SEQIDN0.3)。
[0014] 一种编码本发明所述小干扰RNA的DNA序列属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明提供一种表达载体，其包含编码上述小干扰RNA的DNA序列。
[0016] -种宿主细胞，其为可表达本发明所述小干扰RNA的细胞。
[0017] 一种含有上述小干扰RNA的药物属于本发明的保护范围。
[0018]进一步地，所述的药物为抗肿瘤的药物。所述的肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前 列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鳞状细胞癌和胰腺癌。
[0019]进一步地，所述的药物为免疫治疗剂。
[0020] -种可表达上述小干扰RNA的细胞系也属于本发明的保护范围。
[0021 ]本发明提供了上述小干扰RNA在制备调节细胞或生物体中的TWIST1基因表达药物 中的用途。
[0022] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备抑制肿瘤细胞迀移和侵袭的药物中的用途。
[0023]优选地，所述肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、胃 癌细胞、膀胱癌细胞、食道鳞状细胞癌细胞和胰腺癌细胞。
[0024]本发明提供了上述小干扰RNA在制备治疗疾病的药物中的用途，所述的疾病为黑 色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鳞状细胞癌和胰腺癌。
[0025]有效的靶向治疗是目前国内外不断寻找的辅助治疗方法，本发明提供的特异性靶 向针对TWIST1基因的siRNA转染黑色素瘤细胞后，发现siRNA能够显著下调TWIST1基因的表 达，有效抑制肿瘤细胞的迀移和侵袭能力，对于开发新的抗肿瘤基因药物和肿瘤药物的治 疗效果具有重要指导作用，可用于开发制备抗肿瘤药物，将会取得巨大的社会效益和经济 价值。
【附图说明】
[0026]图1为本发明的siRNA对A375细胞TWIST1基因表达的敲低效果。其中1:未转染siRNA的A375细胞;2:转染阴性对照序列的A375细胞;3:转染siRNA的A375细胞。
[0027]图2为A375细胞中TWIST1基因mRNA敲低水平的电泳检测结果，其中泳道1:分子量 标记;泳道2:转染siRNA的A375细胞;泳道3:转染阴性对照序列的A375细胞;泳道4:未转染 siRNA的A375细胞。
[0028] 图3为A375细胞TWIST1蛋白敲低水平的Westernblot检测，其中泳道1:未转染siRNA的A375细胞;泳道2:转染阴性对照序列的A375细胞;泳道3:转染siRNA的A375细胞。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0030] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规