一种特异性抑制magea1基因表达的小干扰rna及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及一种特异性抑制MAGEA1基因表达的 小干扰RNA及其应用。
【背景技术】
[0002] RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是指是指在进化过程中高度保守的、由双 链RNA(double_strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，RNA分子通 过破坏特定的mRNA，以抑制某种基因表达的生物学过程。该技术具有以下几点优势：1高效 性;2特异性;3位置效应;4高稳定性;5可传播性;6浓度时间依赖性。由于使用RNAi技术可以 特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术迅速成为基因功能研究和基因治疗研究领域最 受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领 域。
[0003] 恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM):是源自于黑色素细胞的一种恶性肿瘤， 好发于皮肤，恶性程度高，治疗难度大。虽然黑素瘤仅占全部皮肤肿瘤的4%，但却占皮肤肿 瘤死亡人数的80%，是皮肤肿瘤中死亡率最高的一种恶性肿瘤。美国国家癌症研究所(NCI) 的数据显示，在2003-2007年间，患病人数为每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估计有 68130个患者被诊断患有黑色素瘤，其中8700个患者将因此丧生（http:// www.cancer.gov/)。恶性黑色素瘤的发生率在全世界范围内正在不断地上升，包括以前发 病率低的地区，它已成为一种严重威胁人们健康的恶性疾病。在中国黑色素瘤患者有逐年 增高的趋势。北京市八城区统计资料显示，2000年MM发病率为0.2例/10万，到了2004年已达 1例/10万。根据中国临床肿瘤协会(CSC0)黑色素瘤专家委员会发表的《中国黑色素瘤诊治 指南（2011版）》，我国每年新发病例约2万例，已经成为了严重危及我国人民健康的疾病之 〇
[0004] MelanomaantigenfamilyAl(MAGEAl)是MAGE基因家族成员之一，该家族共有12 个同源基因，编码蛋白序列具有50%-80%的相似性，而启动子区和第一外显子区差异相对 比较大。MAGEA1是1991年由VanderBruggeon等人从一例患有黑色素肿瘤但是临床表现良 好的病人身上所分离得到的。MAGEA1基因所编码的蛋白能够被人体毒性T淋巴细胞克隆 (CTL克隆）识别。MAGEA1基因所编码的蛋白可以与SKIP蛋白发生相互作用并且通过招募组 蛋白去乙酰酶(HDAC-1)，从而调控某些特定基因的转录。MAGEA1染色质定位于人类X染色体 q28区域，该基因全长1755bp，主要由3个外显子和2个内含子组成。编码蛋白309个氨基酸长 度，一般认为MAGEA1在细胞内主要分布在细胞核和锚定在细胞膜上，正常情况下，MAGEA1仅 在雄性生殖系统和胎盘表达，通常在恶性肿瘤细胞中不表达，其原因是该基因的启动予处 CpG岛的甲基化。近年来研究发现在多种肿瘤当中，包括黑素瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤、膀 胱癌以及非小细胞肺癌中也存在MAGE-A1基因的表达，因此MAGEA1被称作癌症生殖 (cancer-germline，CG)基因或者肿瘤睾丸抗原（cancer-testisantigen，CTA)基因。 MAGEA1编码的蛋白在肿瘤细胞表面可被细胞毒性T淋巴细胞识别，经过抗原递呈以及机体 免疫应答，产生体液免疫和细胞免疫的应答效应，因此MAGEA1基因被视为潜在的肿瘤疫苗 靶点。
[0005]由于当前对MAGEA1的研究进展有限，其在生殖系统和肿瘤中的生物学功能还不是 非常清楚，但可以肯定的是，MAGEA1编码的分子参与了多种分子功能调节并发挥一系列作 用。下调MAGEA1的表达，可以有效抑制肿瘤细胞的迀移和侵袭能力，目前针对下调MAGEA1的 表达研究，特别是特异性抑制MAGEA1表达的小干扰RNA报道较少。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种能够特异性抑制MAGEA1基因表达的小干扰RNA (siRNA)及其应用。
[0007] 本发明根据RNAi发生原理，设计并合成了针对MAGEA1基因的小干扰RNA，其GC含量 为42.11%，且正义链和反义链的长度均为19nt。
[0008] 进一步地，本发明的小干扰RNA双连体分子的正义链和反义链序列分别为：
[0009]正义链：5 'GUCCUUGAGUAUGUGAUCAdTdT-3'，（SEQIDN0 ·1)
[0010] 反义链：5'-TdTdCAGGAACUCAUACACUAGU-3'（SEQIDN0.2)。
[0011] 本发明提供的上述小干扰RNA，能够特异性下调细胞或生物体中MAGEA1基因的表 达量。
[0012] 进一步地，本发明的小干扰RNA作用于MAGEA1基因的靶序列为：5'_ GTCCTTGAGTATGTGATCA-3'（SEQIDN0.3)。
[0013] 一种编码本发明所述小干扰RNA的DNA序列属于本发明的保护范围。
[0014]本发明提供一种表达载体，其包含编码上述小干扰RNA的DNA序列。
[0015] -种宿主细胞，其为可表达本发明所述小干扰RNA的细胞。
[0016] 一种含有上述小干扰RNA的药物属于本发明的保护范围。
[0017]进一步地，所述的药物为抗肿瘤的药物。所述的肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、神经母 细胞瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、精原细胞瘤、食道癌、白血病、淋巴瘤、 肉瘤。
[0018]进一步地，所述的药物为免疫治疗剂。
[0019] -种可表达上述小干扰RNA的细胞系也属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备调节细胞或生物体中的MAGEA1基因表达药物 中的用途。
[0021] 本发明提供了上述小干扰RNA在制备抑制肿瘤细胞迀移和侵袭的药物中的用途。
[0022] 优选地，所述肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、神经母细胞瘤细胞、膀胱癌 细胞、非小细胞肺癌细胞、大肠癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、精原细胞瘤细胞、食道癌细胞、 淋巴瘤细胞、肉瘤细胞。
[0023]本发明提供了上述小干扰RNA在制备治疗疾病的药物中的用途，所述的疾病为黑 色素瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、精原细胞瘤、食 道癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤。
[0024]有效的靶向治疗是目前国内外不断寻找的辅助治疗方法，本发明提供的靶向针对MAGEA1基因的siRNA转染黑色素瘤细胞后，发现siRNA能够显著下调MAGEA1基因的表达，有 效抑制肿瘤细胞的迀移和侵袭能力，对于开发新的抗肿瘤基因药物和肿瘤药物的治疗效果 具有重要指导作用，可用于开发制备抗肿瘤药物，将会取得巨大的社会效益和经济价值。
【附图说明】
[0025]图1为本发明的siRNA对A375细胞MAGEA1基因表达的敲低效果。其中1:未转染siRNA的A375细胞;2:转染阴性对照序列的A375细胞;3:转染siRNA的A375细胞。
[0026]图2为A375细胞中MAGEA1基因mRNA敲低水平的电泳检测结果，其中泳道1:分子量 标记;泳道2:转染siRNA的A375细胞;泳道3:转染阴性对照序列的A375细胞;泳道4:未转染 siRNA的A375细胞。
[0027]图3为A375细胞MAGEA1蛋白敲低水平的Western blot检测，其中泳道1:未转染siRNA的A375细胞;泳道2:转染阴性对照序列的A375细胞;泳道3:转染siRNA的A375细胞。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下