hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用，特别是涉及一种hTERT基因全硫代修饰的反义寡核苷酸、包含有藏药镰状棘豆总黄体酮(TF0F)的药物组合 物，以及它们在用于制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用，属于基因药物技术领 域。
【背景技术】
[0002]前列腺癌是男性泌尿系最常发生的肿瘤之一，在美国其发病率在肿瘤患者中占第 一位，死亡率占第二位。研究表明，前列腺癌细胞属于雄激素依赖性细胞，通过抑制人体雄 激素的产生，前列腺癌细胞生长速度变缓，出现惰性生长的现象，甚至出现前列腺癌转移灶 萎缩的情况，治疗效果良好。随着抗雄药物的治疗，前列腺癌细胞会由雄激素依赖性转化为 雄激素非依赖型，抗雄药物治疗会逐渐失去作用。雄激素非依赖型前列腺癌的治疗是临床 上最棘手的问题之一。最新研究表明，雄激素可以调节前列腺癌细胞的端粒酶活性。现已证 明hTERT基因mRNA与端粒酶活性表达一致，其上游表达对端粒酶活性表达起重要作用，被认 为是端粒酶活性表达的限速因子。雄激素阻断会导致前列腺癌细胞端粒酶限速因子hTERT 基因的表达活性受到抑制伴有癌细胞端粒酶活性的降低，因此使用端粒酶抑制剂替代雄激 素可以降低雄激素非依赖型前列腺癌端粒酶的活性。人类端粒酶主要在雄激素非依赖型前 列腺癌中表达，而在正常组织及良性肿瘤中不表达，表明端粒酶激活与该疾病发生过程关 系密切。
[0003] 镰状棘豆为豆科棘豆属(oxytropisD.C.)植物镰状棘豆(O.falcataBunge)的干 燥全草，是一味重要的藏药。镰状棘豆味辛、性寒，有小毒，具有清热解毒，生肌愈疮，抗炎镇 痛，涩脉止血等功效。在藏药中有"草药之王"的美誉。镰状棘豆主要含有黄酮，生物碱，皂苷 类等成分，药理研究表明，具有镇痛，抗炎，抗氧化，抗肿瘤等活性。有实验研究藏药镰状棘 豆总黄酮(TF0F)对肝癌细胞SMMC-7721凋亡作用的影响。
[0004]反义技术的基本原理就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互 补的DNA或RNA片段(反义核酸）以抑制或封闭专一靶基因表达的技术，有理由发展成为一种 新的基因治疗药物。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种hTERT基因全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-0DN)，其可以对氟 它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性产生影响，另外，本发明还提供一种药物组合 物，反义寡核苷酸与镰状棘豆总黄酮（TFOF)，ASPS-0DN对端粒酶活性抑制作用可以对 TF0F诱导氟它胺耐受型(雄激素非依赖型)前列腺癌细胞LNCaP凋亡产生增敏作用。
[0006]根据本发明的第一个方面： 一种前列腺癌细胞hTERT基因反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5 ' -GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3' 〇
[0007]所述的反义寡核苷酸上的所有碱基是经过硫代修饰的。
[0008]根据本发明的第二个方面： 一种用于治疗氟它胺耐受型前列腺癌的组合物，包括有权利要求1所述的反义寡核苷 酸，以及镰状棘豆总黄酮(TF0F)。
[0009]根据本发明的第三个方面： 包含有上述组合物的药物，所述的药物是以水为载体，其中反义寡核苷酸的浓度是5~ 20_〇1/1，镰状棘豆总黄酮的浓度是0 · 05~0 · 2g/L。
[0010] 根据本发明的第三个方面： 上述的反义寡核苷酸在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。
[0011] 根据本发明的第四个方面： 上述的组合物在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。
[0012]有益效果:hTERT基因反义核酸对TF0F诱导的氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu凋亡有增敏作用。
【附图说明】
[0013]图1 hTERT基因反义核酸与0.1g/L TF0F联合作用48h对LNCaP-flu细胞活力的影响。
[0014] 图2空白样本的流式细胞仪检测散点图。
[0015]图3SPS-0DN样本的流式细胞仪检须撒点图。
[0016]图4ASPS-0DN样本的流式细胞仪检须撒点图。
[0017]图5TF0F样本的流式细胞仪检测散点图。
[0018]图6TFOF+SPS-0DN样本的流式细胞仪检测散点图。
[0019]图7TFOF+ASPS-0DN样本的流式细胞仪检须撒点图。
[0020]图8 hTERT反义核酸与TF0F0.1g/L联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率(A:空白；B: S PS-ODN; C: AS PS-ODN; D: TFOF; E: TFOF+S PS-ODN; F: TFOF+AS PS-0DN)〇
【具体实施方式】
[0021 ]实施例1材料和方法 1.1.1主要试剂 RPMI 1640培养粉为北京天为时代科技有限公司产品，胎小牛血清为兰州民海生物制 品公司产品，台盼蓝为兰州百奥生物制品公司产品，藏药镰状棘豆总黄酮(TF0F)为武汉博 士德生物制品公司产品。Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒为北京天为时代科技有限公司产 品。
[0022] 1.1.2引物合成 根据hTERT基因mRNA的序列分析，设计出互补于起始密码子的反义片段共20个碱基长 度作用的靶序列。
[0023] 反义片段hTERTASPS-0DN的序列为5'-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3'（SEQIDN0·l)。
[0024]作为对照的正义片段SPS-0DN的序列为5'-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3'（SEQID N0.2)〇
[0025]以上每条链进行碱基全部硫代修饰，由北京赛百胜生物制品公司合成，纯化，分 装。
[0026] 1.1.3细胞培养 LNCaP细胞株由兰州大学第二医院泌尿研究所惠赠。采用含10%胎小牛血清(60°C灭活3 min)，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的RPMI-1640培养液，在37°C，5%C02饱和湿度条件下 培养。LNCaP细胞含10%FBS的RPMI1640培养液中。羟基氟它胺用无水乙醇溶解后加入磷酸盐 缓冲液(PBS，常规培养于pH7.2)至羟基氟它胺终浓度为l(T4m〇l/L储存。LNCaP加入羟基氟它 胺至终浓度为l(T7m〇l/L后连续培养80代，使之成为氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu， 实验选用对数生长期细胞。
[0027] 1.1.4镰状棘豆总黄酮的制备 取镰状棘豆干药材l〇〇g，经95%，50%乙醇依次提取，减压回收乙醇，加2%NaOH溶解，滤 过，滤过液加1%HC1调至pH值为5,以氯仿、乙酸乙酯依次萃取，合并萃取液，浓缩至干，得镰 状棘豆总黄酮。将所得总黄酮部位进行纯度测定。
[0028] 1 · 1 · 5TF0F样品的配制 称取镰状棘豆总黄酮适量，以无血清DMEM培养基为基质，二甲基亚砜(DMS0)助溶，DMS0终浓度为0.5%。过滤除菌，4°C保存备用。
[0029] 1.1.6统计学分析方法数据采用均数+标准差表示，使用SPSS16.0统计学软件， 采用单因素方差分析进行统计学处理，以P〈〇. 05确定为有统计学意义。
[0030] 1.1.7hTERTASPS-0DN最适作用浓度的选择 实验分为ASPS-0DN组，SPS-0DN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每 孔接种1X105细胞。寡核苷酸浓度分为4组，第1天向培养液中分别加入5，10，15,20μ