一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记gga-miR-1416-5p及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子 标记gga-miR-1416-5p及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)为革兰氏阴性菌，是世界公认的食源性 致病菌之一，不仅对蛋鸡生产造成重大影响，而且它能通过家禽副产品给人类的健康带来 很大的威胁。这种病菌主要是通过动物性产品包括禽肉，鸡蛋和奶类及奶制品等导致人中 毒甚至死亡。因此如何获得抗性高的遗传个体成为亟待解决的问题之一。
[0003] 小RNA(miRNA)是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA，与靶基因3'UTR(非翻译 区）结合在转录后水平调控靶基因的表达，在细胞增殖、分化、凋亡、神经发育、脂肪代谢等 多个生物学过程中发挥重要作用。
【发明内容】
[0004]本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种鸡 肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNAgga-miR-1416-5p，发明人经过研究发现，gga-miR-1416-5p可以通过调控TLR21基因的表达调控 肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1416-5p可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的 分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。
[0005]发明人提供的具体技术方案如下：
[0006]发明人首先提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记，该抗性分子标 记为鸡miRNAgga-miR-1416-5p，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示；
[0007]发明人进一步给出了该分子标记的检测方法如下：
[0008]gga-miR-1416_5p的表达量检测
[0009]miRNA反转录
[0010] 用OneStepP:riiteS.cri.pt?miRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime) 试剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20yL(具体见表1)。反应程序为:37°C，60min; 85 °C，5s;反应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用；
[0011] 表1miRNA反转录体系(20μυ
[0012]
[0013 ]其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0014] gga-miR-1416-5p荧光定量PCR
[0015] 根据gga-miR-1416-5p成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合 成。利用所设引物，采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptTM miRNART-PCRKit说明书，在StratageneMX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如 表3所示。
[0016] 表2miRNA定量检测引物
[0017]
[0018]其中〉gga-miR-1416_5p和U6分别作为ForwardqPCRPrimer，而Uni-miRqPCR Primer选用试剂盒中自带引物；
[0019] 荧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，l个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环；最后添加溶解曲线(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，1个循环，每个cDNA样品重复三 次。以U6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0020] 表3荧光定量PCR体系（20μυ
[0021]
[0022] 发明人为了验证上述gga-miR-1416-5p的功能采用了革El基因检测的方式，利用 TargetScan及miRanda等软件预测到TLR21是gga-miR-1416-5p的革E基因。结果发现通过分 别比较肠炎沙门氏菌感染组与未感染组中miRNA与革E1基因的调控方向，可知gga-miR-1416-5p在感染组中显著上调，靶基因TLR21在感染组中的表达量显著低于未感染组（如图1所 示），即gga-miR-1416-5p与TLR21调控方向相反，表现出相互作用关系，与生物信息学预测 结果一致。说明gga-miR-1416-5p可以通过调控TLR21基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的 感染。因此gga-miR-1416-5p可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记。
[0023]综上所述，本发明提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记及其检测 方法，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-1416-5p，发明人经过研究发现，gga-miR-1416-5p可以通过调控TLR21基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1416-5p可 以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为 鸡的抗病遗传育种奠定基础。
【附图说明】
[0024] 图1为RNAgga-miR-1416-5p与靶基因TLR21在感染组相对未感染组中的表达差异 倍数柱状图，
[0025] 由图可知，gga-miR-1416-5p在感染组中显著下调，TLR21在感染组中的表达量显 著高于未感染组，即gga-miR-1416-5p与TLR21调控方向相反，表现出相互作用关系，说明gga-miR-1416-5p可以通过调控TLR21基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染。
【具体实施方式】
[0026]下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
[0027]实施例1
[0028] gga-miR-1416_5p的表达量检测
[0029]miRNA反转录
[0030] 用OneStep.PrimeScript?miRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime) 试剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20yL(表1)。反应程序为：37°C，60min; 85°C，5s; 反应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用；
[0031] 表1miRNA反转录体系（20yL)
[0032]
[0033]其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0034] gga-miR-1416_5p焚光定量PCR
[0035]根据gga-miR-1416-5p成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合 成。利用所设引物，采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptTM miRNART-PCRKit说明书，在StratageneMX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如 表3所示。
[0036]表2 miRNA定量检测引物
[0037]
[0038]其中〉gga-miR-1416_5p和U6分别作为ForwardqPCRPrimer，而Uni-miRqPCR Primer选用试剂盒中自带引物；
[0039] 荧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环;最后添加溶解曲线(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，一个循环，每个cDNA样品重复三 次。以U6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0040] 表3荧光定量PCR体系（20μυ
[0041]
[0042] 实施例2
[0043] 靶基因TLR21的表达量检测
[0044] mRNA反转录
[0045] 根据试剂盒说明书要求，利用TaKaRaPrimerScriptTMRTreagentkit (PerfectRealTime)试剂盒将mRNA反转录为cDNA，放在-20°C保存备用。反转录体系如表4 所示。反转录步骤:37°C，15min;85°C，5s。
[0046] 表4反转录体系
[0047]
[0048] TLR21 荧光定量PCR
[0049] 根据NCBI数据库mRNA序列（登录号:NM_001030558)，用PrimerPremier5.0设计荧 光定量PCR引物(表5所示），引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0050] 表5引物序列
[0052] 采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqTM说明书，在StratageneMX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系为20yL(表6):SYBRPrimerEx TaqTM(2X)10μ1,ForwardPrimer(10μΜ)0.4μ1,ReversePrimer(10μΜ)0.4μ1,ROX ReferenceDyeΠ(50X)0 · 4yL，cDNA模板2yL，灭菌双蒸水（ddH2〇)6·8yL，终体积20yL。反应 程序为两步法:95°C预变性30s，PCR反应为:95°C，5s; 60°C，30s;循环40次;添加溶解曲线： 95°C，lmin; 61°C，30s; 95°C，30s;每个样品重复3次。以β-actin作为内参，用2-ΔΔCt方法 来计算mRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差分析对mRNA表达量差异进行分析。 [0053] 表6荧光定量PCR体系 [0054]
[0055] 实施例3
[0056]鸡接种肠炎沙门氏菌试验
[0057]将沙门氏菌阴性白来航蛋鸡分为感染组与未感染组，感染组每只鸡接种5.8X l〇8CFU肠炎沙门氏菌，未感染组接种磷酸盐缓冲液(PBS)，接种后第7天采集盲肠组织样品。 按照使用说明，用Trizol法提取盲肠总RNA。
[0058] gga-miR-1416-5p与肠炎沙门氏菌感染的相关性分析
[0059]利用实施例1所述方法，检测肠炎沙门氏菌感染后盲肠组织gga-miR-1416-5p表达 变化。定量结果显示，gga-miR-1416-5p在感染组盲肠中的表达量显著高于未感染组(Fold change=2.15)。说明gga-miR-1416-5p与肠炎沙门氏菌感染具有较强的相关性。
[0060] TLR21与肠炎沙门氏菌感染的相关性分析
[0061]利用实施例2所述方法，检测盲肠TLR21表达与肠炎沙门氏菌感染的相关性。结果 显示，感染组TLR21的表达量显著低于未感染组，是未感染组的-1.33倍（P〈0.05)。说明 TLR21与鸡肠炎沙门氏菌感染相关。
[0062]gga-miR-1416-5p与其靶基因TLR21的互作分析
[0063] 通过分别比较感染组与未感染组中miRNA与革E1基因的调控方向，可知gga-miR-1416-5p在感染组中显著上调，TLR21在感染组中的表达量显著低于未感染组（如图1)，即gga-miR-1416-5p与TLR21调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-1416-5p可以 通过调控TLR21基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染。因此gga-miR-1416-5p可以作为 肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记。
【主权项】
1. 一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记，该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-1416-5p，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2. 权利要求1所述鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记检测方法，具体步骤如下： gga-miR-1416-5p的表达量检测 miRNA反转录 用One StepPrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit试剂盒，严格按说明书进行;反 转录体系为20yL，如表1所示;反应程序为:37°C，60min; 85°C，5s;反应完成后获得的cDNA置 于-20°C保存备用； 表1 miRNA反转录体系(20yL)gga-miR-1416_5p 焚光定量 PCR 根据gga-miR-1416-5p成熟序列设计引物，如表2所示;利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit说明书，在Stratagene MX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所示； 表2 miRNA定量检测引物表3荧光定量PCR体系荧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40个循 环;最后添加溶解曲线（），1个循环，每1.样品重复三次；以 U6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差分 析对gga-miR-1416-5p表达量差异进行分析。
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNA？gga-miR-1416-5p，发明人经过研究发现，gga-miR-1416-5p可以通过调控TLR21基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-1416-5p可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。
【IPC分类】C12N15/113, C12Q1/68
【公开号】CN105462982
【申请号】CN201610015294
【发明人】李显耀, 吴桂贤, 刘丽英, 刘肖意
【申请人】山东农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月11日