疣粒野生稻bZIP1基因的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术领域，涉及一种疣粒野生稻bZIPl基因，具体包含一个来 源于疣粒野生稻的抗白叶枯病相关基因的分离克隆和功能分析，尤其涉及疣粒野生稻DNA 序列和该DNA序列对水稻对白叶枯病抗性的影响。
【背景技术】
[0002] 水稻是人类最重要的粮食作物之一，高产一直是水稻育种选择的重要农艺性状， 也是农业生产追求的主要目标。然而，水稻的产量往往受到生物或者非生物逆境的影响。白 叶枯病，由黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.0ryzae，Xoo)引起，是一个严重的全球性 水稻病害。水稻是亚洲许多国家的主要粮食，因此水稻白叶枯病对亚洲国家粮食生产的威 胁尤为严重（Singhetal. 2001;Centuryetal. 1999)，该病害也一直是影响我国水稻高 产、稳产的一个重要原因。据统计，在发病较重的年份和地区该病引起的水稻减产高达50% 甚至绝收(章琦等，2007)。实践表明，使用抗病品种是防治白叶枯病最经济有效且环境影响 小的技术措施。但是，由于白叶枯病生理小种变异频繁，新的抗性品种在种植几年后往往又 会变为易感(Hulbertetal.2001)。例如，日本的抗病品种"朝风"，在种植后不久就遭遇当 地毒性菌株的侵袭，另外在韩国、印度、菲律宾和我国南方部分稻区也发现有能侵染带Xa21 抗病基因水稻的毒性囷株(Goeletal.，1998;Leeetal.，1999;曾列先等，2002;姬广海 等，2003)。因此，挖掘利用新的抗病基因资源，拓展抗病基因资源;研究相关抗病机理，提升 和延展抗病基因的功能，成为目前水稻抗病育种的重要研究内容。
[0003]由于自然选择的结果，野生稻对环境适应性要远高于栽培稻，对水稻各种病害具 有较好的抗性(BrarandKhush1997)。野生稻遗传资源在水稻育种工作已经起到了很多 积极的作用。由于众多学者的不懈努力，多个来源于野生稻的白叶枯病抗性基因已被定位 或克隆，包括来源于普通野生稻（OrizarufipogonGriff.)的Xa23(Zhangetal.1996)， 小粒野生稻（O.minuta)的Xa27(Amante_Bordeosetal.l992;Wuetal.2008)，药用野生 稻O.officinalis的Xa29(Tanetal.2004)和普通野生稻的Xa30(Jinetal.2007)等。来 源于长雄蕊野生稻(〇·longistaminata)的Xa21基因（Songetal· 1995)更是被广泛的应用 于农业生产和基础科学研究。疣粒野生稻为GG组，和普通栽培稻的亲缘关系较远(Brarand Khush1997)。研究表明，其对白叶枯病的抗性非常高（章琦，1994)。通过多年研究，我们确 定了多个来源于疣粒野生稻的抗白叶枯病候选基因，并进行了转基因验证。结果显示，其中 一基因的能显著影响水稻对白叶枯病的抗性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种疣粒野生稻bZIPl基因。
[0005]本发明的第一个目的是提供疣粒野生稻中分离的OmbZIPl基因，本发明的第二个 目的是提供了增强水稻对白叶枯菌抗性的新方法。这种方法包括将OmbZIPl基因与能够表 达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体、转入水稻以提高水稻对白叶枯病抗性的方 法。
[0006] 本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种疣粒野生稻bZIPl基因，其DNA 序列是SEQIDN0:1所示的DNA序列，或者基本上相当于SEQIDN0:1的DNA序列。OmbZIPl总 长1413bp(碱基对）。其中最前端AGT为起始符，根据三联体密码规则计算，最后三个字符TAA 为终止符，可见是个完整的基因。
[0007]疣粒野生稻bZIPl基因作为增强水稻对白叶枯病抗性中的应用。
[0008]所述的DNA序列与适合启动子连接，能够使水稻产生双链RNA。
[0009] 本发明的有益效果为:本发明克隆并坚定了疣粒野生稻中一基因（OmbZIPl)，该基 因和栽培稻中的一bZIP型转录因子高度同源。对获得的转基因材料进行鉴定后发现，该基 因的能影响水稻对白叶枯病的抗性，增强了水稻对部分白叶枯小种的抗病。
【附图说明】
[0010]图1.是具有OmbZIPl基因遗传背景的To代材料。采用Ubiquitin启动子驱动的OmBBRl基因转入石首白毛。To代转基因材料RT鉴定显示，OmBBRl基因表达均较强。而OmBBRl 的转基因生长较矮小且育性下降;接种白叶枯菌后OmBBRl转基因材料显示出较高的抗性。 [0011] 图2.是具有OmbZIPl基因亚细胞定位。35s启动子表达sGFP: 融合蛋白主要 定位于细胞核内；Ubiquitin启动子驱动的融合蛋白的也主要定位于细胞核内。
[0012] 图3.是具有OmbZIPl自身互作。BiFC互作载体的结构示意图，nYFP: 融合蛋 白和cYFP: :OmBBRl融合蛋均采用35s启动子驱动表达;共转化烟草的瞬时实验显示OmBBRl蛋白具有很强的自身互作，互作位点位于细胞核中。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。
[0014] 实施例1:
[0015] 1.疣粒野生稻OmbZIPl基因的克隆
[0016] 1.1.疣粒野生稻RNA制备
[0017] ⑴试剂：
[0018] Solution I连接酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技 有限公司；DNA片段回收试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶和cDNA第一链合成试剂盒 购自NEB公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；高保真DNA聚合酶购自Τ0Υ0Β0公司；IPTG (Isopropyl-l thio-P-galactoside，异丙基-硫代-β-D-半乳糖昔）；X_gal (5_brom〇-4-chlor〇-3_indolyl-0-D-galactoside，5_溴-4-氯-3-吲噪-β-硫代半乳糖苷）；卡那霉素 (Kanamycin，Kan);氨节青霉素(Ampici 11 in，Amp);链霉素（streptomycin，Str);液氮;二乙 基焦碳酸酯（diethylprocarbonate DEPC);无水乙醇；氯仿；异丙醇;Na2EDTA;冰醋酸；甘 油;胰蛋白胨;酵母浸膏;NaCl;琼脂
[0019]由上海英俊生物技术有限公司（Invitrogen)和生工生物工程(上海)有限公司进 行引物合成。
[0020] (2)仪器：
[0021] 超净工作台、手术刀、250ml三角形烧瓶、移液枪、恒温干燥箱、枪头、高压灭菌锅、 研钵、制冰机、小勺、一次性塑料手套、恒温培养箱、电泳仪、接种针、离心管、酒精灯、PCR仪、 台式低温离心机、超低温冰箱、-20°C冰箱、4°C冰箱、水浴锅、小型电泳装置、超微量分光光 度计、培养皿、恒温摇床、涡旋仪、高压灭菌锅等。
[0022] (3)相关软件及数据库：
[0023] 引物设计米用Oligo6Demo,序列分析比对米用VectorNTIAdvance10和DNA STAR-LesergeneV6，序列同源性分析在NCBI(http://www·ncbi·nlm·gov/)和RAP·DB (http://rapdb·dna·affrc·go·jp/)上进行。
[0024] 1.2.材料、菌株与载体
[0025] 植物材料为疏粒野生稻(Oryzameyeriana)。大肠杆菌菌株(Escheichiacoli， DH5a)，农杆菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens，EHA105)和酵母菌株(Y2HGold)以及水稻 白叶枯菌(Xanthomonas<^}^36。￥.(^5^36，乂〇〇)菲律宾生理小种？10为本实验室保存。
[0026] 1.3.总1?熟的提取
[0027] 疣粒野生稻生长条件为：温度28-32°C，湿度：60-80 %，光照250micromol/m2 ·s白 光，光周期为12h/d。
[0028] (1)按样品数量准备好RNaseFree的2mlEP管，并放入高温烘烤过的震荡用玻璃 珠；
[0029] (2)选取鲜嫩幼叶75mg，放入2mlEP管中（14天苗岭苗和2mlEP管等长叶片约 25mg，故取等管长的叶片3段），立即放入液氮冷冻；
[0030] (3)将震荡适配器用液氮预冷，再将取样用的2mlEP管放入配器，安装并锁紧适配 器后，25Hz震荡1.5min;
[0031] (4)每管(75mg组织）加lmlTRIzo1试剂(添加TRIzol时，要保证样品低温，切莫同时 从液氮中取出多管样品，导致样品升温降解。每次从液氮保存罐中取出1~2管样品，加 TRIzo1后立即晃动，直至TRZo1融化并和样品完全混匀）；
[0032] (5)匀浆后，室温(气温低时用25°C金属浴)放置5min;
[0033] (6)每管样品加氯仿0.2ml(按每mlTRIzol加0.2ml氯仿计），手工振荡15秒；
[0034] (7)室温(气温低时用25°C金属浴)静置5分钟后，4°C，12000g，15min(此步骤离心 后，要格外小心）；
[0035] (8)用20〇111枪头缓缓吸取上清（一般为0.51111)到一新的1?^86?代6的1.5111找？管 (离心后的EP管要尽量轻拿轻放，移液时绝对不要碰到中间的蛋白层，液面越接近蛋白层， 移液速度越要慢，以免因液体流动激起中间的蛋白层，如无把握，可以少吸取一些上清）， [0036] (9)可选步骤(建议操作）：加等体积的氯仿异戊醇(一般为0.5ml)，手工振荡15秒， 静置5min后，4°〇，1200(^，1〇111；[11离心，取上清无色水相（一般为0.5ml)到RNaseFree1.5mlEP管(注意事项与前一步一样，离心后的EP管尽量轻拿轻放，移液时，不要碰到中间的 蛋白层，移液速度要慢，以免激起中间的蛋白层，如无把握可以少吸取一些上清）；
[0037] (10)加等体积的异丙醇(一般为0.5ml)，颠倒数次混匀，室温(气温低时用金属浴） 静置十分钟；
[0038] (11 )4°C，，12000g，10min，离心。可见总RNA在官底的白色沉淀，弃去上清；
[0039] (12)吸干残留的异丙醇。调整移液器到200L刻度，用枪头吸取约180L75%乙醇， 再吸取约20ul空气，轻轻搅动的RNA粘在枪头上，以减少RNA损失；
[0040](13)补充加入75%乙醇lml，颠倒混匀数次后，4°C，7500g，5min，离心。
[0041] (14)重复上诉洗涤步骤；
[0042] (15)去上清，用200L枪头尽量吸干液体，真空干燥沉淀5~10分钟（用旋转蒸发仪 时，不要开离心功能，30°C抽干约5分钟时，可见残留液体逐渐减少，RNA由白色变为透明，此 时为最佳干燥效果。如果继续干燥则会由透明变白，导致RNA难溶，且导致0D260/280〈1.6);
[0043] (16)加DEPC水 20 ~30L，溶解总RNA;
[0044] (17)测0D值跑电泳确认RNA质量，加入后继续步骤或_80°C冻存。
[0045] 1.4.RNA的逆转录
[0046] (1)引物设计：
[0047] 以提取的水稻总RNA为模板，参照invitrogenTMM-MLV逆转录酶说明书进行逆转 录。在RNAase-Free的PCR管中加入以下成分。
[0049] 将加入上诉混合物的PCR管置于65°C，5min后，迅速置于冰上5-10min。加入以下成 分lOxbuffer2.5L，M-MLV逆转录酶lL，RNaseOUT?核酸酶抑制剂0.5L，Nuclease-Free Water2.5L至最终体积为20L。混匀后在42°C放置lh，然后在90°C加热lOmin来终止反应。将 逆转录产物放于_20°C，保存备用。
[0050] 依据0SWRKY7基因的0RF序列用软件01 igo设计引物，用于PCR扩增。引物由生工公 司合成。
[0051]
[0052] (2)PCR扩增
[0053]以疣粒野生稻cDNA为模板，PCR扩增⑶S序列。扩增体系参考KODFXDNA聚合酶说 明书，体系如下
[0055]扩增条件为98°C预变