一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法

文档序号:9703050阅读:625来源:国知局
一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程与生物能源领域,具体而言是一种检测微生物细胞中脂肪烃 的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法。
【背景技术】
[0002] 发展生物燃料是解决人类所面临的资源、能源与环境等方面问题的有效途径之 一。由于脂肪烃是汽油、柴油、航空煤油等发动机燃料的主要成分,具有高能量密度、低吸湿 性与低挥发性,并且与现有运输设施及发动机系统相匹配,生物脂肪烃已经被认为是一种 最有潜力的优质生物燃料。
[0003] 近年来,在生物体中发现的脂肪烃合成途径主要有五种,由不同的酶催化完成 (WangW,LuX:MicrobialBiosynthesisofAlka(e)nes.FrontiersinBioengineering andBiotechnology. 2013, 1(10): 1-5)。例如,在蓝细菌中主要存在一条两步法合成脂 肪经的途径,即脂酰ACP(fattyacylacyl-carrierprotein)在脂酰ACP还原酶(acyl acyl-carrierproteinreductase,AAR)作用下生成脂肪酸,脂肪酸再经脂肪酸脱甲 酰加氧酶(aldehyde-deformylatingoxygenase,AD0)催化脱甲酰基生成脂肪经和甲 酸(SchirmerA,RudeMA,LiΧΖ,PopovaΕ,delCardayreSB:MicrobialBiosynthesis ofAlkanes.Science2010, 329(5991) :559-562)。此外,在Jeotgalicoccus菌中存在 一种细胞色素P45001eT,它能够直接将脂肪酸脱羧基生成具有末端不饱和双键的烯烃 (RudeMA,BaronTS,BrubakerS,AlibhaiM,DelCardayreSB,SchirmerA:Terminal Olefin(1-Alkene)BiosynthesisbyaNovelP450FattyAcidDecarboxylasefrom JeotgalicoccusSpecies.AppliedAndEnvironmentalMicrobiology2011, 77(5):1718-1 727)。目前上述途径均已实现在大肠杆菌或蓝细菌中重组表达,且成功检测到C15、C17、C19 等脂肪烃的合成,表现出较好的发展前景。
[0004] 一些具有天然脂肪烃生物合成途径的微生物合成脂肪烃的效率都很低,并不具 备工业应用潜力。因此,通过生物工程技术手段在一些具有工业应用潜力的模式微生物 中(如大肠杆菌、酵母、蓝细菌等),大幅度提高脂肪烃的生物合成效率是当前的研究重点 (KailioP,PasztorA,AkhtarMK,JonesPR:Renewablejetfuel.CurrentOpinionin Biotechnology2014, 26:50-55),而实现对细胞内脂肪烃含量的快速检测是实施脂肪烃生 物合成途径工程改造的一个关键性的前提条件。然而,由于细胞内脂肪烃含量极低,且通常 难以和其他物质发生化学反应,使得快速检测细胞中的脂肪烃含量成为极大的难题。目前 最常用也是最主要的脂肪烃检测方法是有机溶剂抽提结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)分 析技术,该方法实验操作复杂,流程较长,仪器设备要求高,无法实现大量样品的并行分析, 不能够满足原位快速与高通量检测的要求。
[0005] 近年来,环境微生物学与合成生物学的发展为微量脂肪烃检测提供了新的可能 手段。在不动杆菌(Acinetobacterbaylyi)、假单胞菌(Pseudomonas)等环境微生物 中,存在由脂肪烃诱导的信号通路,该信号通路利用环境中的脂肪烃作为信号分子,诱导 相关蛋白质的表达。通过将某些易于检测的报告蛋白编码基因置于该信号通路的下游, 构建脂肪烃生物传感器元件,即可通过检测由脂肪烃诱导产生的报告蛋白而实现对环 境中脂肪烃的间接检测。基于这一发现,在含烃废水的检测方面已有一些成功的例子, 例如Zhang等(ZhangDY,HeY,WangY,WangH,WuL,AriesE,HuangWE:Whole_cell bacterialbioreporterforactivelysearchingandsensingofalkanesandoil spills.MicrobialBiotechnology2012,5(l):87_97)构建的以A.baylyiADP1 为宿 主的AlkR-PalkM: :LuxCDABE烃传感器,能够检测环境中碳链长度12~24的脂肪烃; Sticher等(SticherP,JaspersMCM,StemmierK,HarmsH,ZehnderAJB,vanderMeer JR:Developmentandcharacterizationofawhole-cellbioluminescentsensorfor bioavailablemiddle-chainalkanesincontaminatedgroundwatersamples.Applied andEnvironmentalMicrobiologyl997, 63 (10) :4053-4060)构建的以E.coliDH5α为宿 主的AlkS-PalkB: :LuxAB烃传感器,能够用于检测环境中的微量辛烷(CSH1S)。基于上述发 现,可以进一步设计和构建用于检测细胞内脂肪烃含量的生物传感器元件,即可以通过将 该生物传感器元件整合进入产烃工程菌,或者说在已整合该生物传感器元件的工程菌中导 入产烃途径,从而实现对细胞中合成的脂肪烃的原位快速检测。目前尚无将这一思路成功 应用于细胞内生物合成脂肪烃检测的报道。
[0006] 目前已报道的脂肪烃生物传感器元件均有各自的局限性,无法实现对细胞中合成 脂肪烃的原位快速检测。例如,已证明来自不动杆菌ADP1的AlkR-PalkM脂肪烃检测元件在 大肠杆菌不能够正常工作(SchirmerA,HuZ,CostaB,USPatent2008/0293060A1),而能够 在大肠杆菌工作的AlkS-PalkB元件对于碳链长度> 9的中长链脂肪烃没有检测效果(Reed B,BlazeckJ,AlperH:Evolutionofanalkane-induciblebiosensorforincreased responsivenesstoshort-chainalkanes.JournalofBiotechnology2012, 158(3):75-7 9) 〇

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是克服目前对于细胞内脂肪烃的现有检测方法操作复杂,仪器要求 高的不足,提供一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方 法。
[0008] 为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
[0009] -种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体,构建体包含至少一个脂肪烃检测元件和 一个报告蛋白兀件;
[0010] 脂肪烃检测元件由具有脂肪烃响应特性的转录激活因子和启动子组成;所述报告 蛋白元件为能够在宿主中功能性表达和被检测的蛋白质
[0011] 进一步的说,所述构建体包含由启动子Palks、转录激活因子AlkR和启动子PalkM 组成的脂肪烃检测元件;以及以绿色荧光蛋白、LacZ、荧光素酶或抗性基因作为的报告蛋白 元件。
[0012] -种原位快速检测细胞内脂肪烃的方法:利用所述构建体将其导入宿主细胞,再 将宿主细胞进行培养并诱导其合成脂肪烃,而后通过检测报告蛋白的表达,从而实现对细 胞内脂肪烃的检测。
[0013] 进一步的说,所述检测是将编码脂肪烃检测元件与报告蛋白基因的DNA通过聚合 酶链式反应连接入含有抗性基因的表达载体中,将所述表达载体导入含有产烃途径或潜在 产烃途径的宿主细胞中;将所述宿主在添加相应抗生素的培养基中进行培养并诱导其合成 脂肪烃,继续培养而后检测报告蛋白的表达水平,即检测到报告蛋白的信号,由此获得脂肪 烃的含量。所述脂肪烃为中长链脂肪烃。所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或
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