利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法

文档序号:9703054阅读:831来源:国知局
利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及一种应用重组载体在丝状真菌中筛选外 源基因的方法。
【背景技术】
[0002] 丝状真菌是一类由有隔菌丝组成的多细胞微生物,具有较强的蛋白分泌能力,可 以产生丰富的次级代谢产物,因此在酶蛋白、药物、化工品等的工业生产中有着重要的应用 (Verdoes et al·,1995;Wang et al·,2005)。
[0003]众多重要的丝状真菌菌株中,黑曲霉和里氏木霉在科学研究及工业生产中应用最 为广泛,两者都是美国食品和药品管理局认证的GRAS(GenerallyRecognizedasSafe)菌 株,里氏木霉主要作为纤维素酶生产菌而受到重视,其野生型因纤维素的降解能力而被鉴 定,经过多轮的诱变筛选,里氏木霉的胞外蛋白产量可以达到l〇〇g/L以上(Cherryand Fidantsef,2003;Xuetal. ,2009),滤纸酶活力可以达到33FPU/ml以上,已经成为最主要 的纤维素酶生产菌。
[0004]菌种改造是提升菌株生产性能的关键,基于基因工程的遗传改造是一种有效的菌 种改造的措施(Meyer,2008)。虽然里氏木霉可以生产完整的纤维素降解酶系,但是胞外酶 液中β-葡萄糖苷酶含量较低,Zhang等使用四个拷贝的cbhl启动子驱动bgll基因在里氏木 霉RutC30中的过表达,将β-葡萄糖苷酶活性提高3.7倍,滤纸酶活提高130 %,酶解玉米芯 产生还原性糖的产量提高29%(Zhangetal.,2010)。
[0005]里氏木霉具有强大的木质纤维素降解能力,因此在联合生物加工(CBP)过程中有 着重要的潜在应用(Singhetal.,1992;Xuetal.,2009),CBP的目的是在菌株中构建高 效的由木质纤维素向化学品(如乙醇、脂肪酸等)的一步转化途径,目前CBP的研究主要集中 在对酵母的纤维素酶产生能力的改造,这主要是由于酵母乙醇产生能力较强,以及其基因 工程的易操作性;但是纤维素酶系组分较多,有效的组合改造难度较大,因此改造纤维素降 解菌的代谢路径,实现化学品的生产为我们提供了另一条CBP的思路。
[0006]构建及筛选性状优良的基因工程菌是一个系统工程,包括基因组水平改造(基于 遗传转化的过表达或敲除基因)、改造后工程菌的筛选以及性状评价等(Moore,2007)。丝状 真菌的遗传转化方法已经相对成熟,包括原生质体转化、农杆菌介导转化、电转化等,将DNA 片段随机地插入到基因组中。但是由于其形态特点,丝状真菌的遗传改造过程相对模式微 生物大肠杆菌、酿酒酵母等更加漫长,丝状真菌菌落为多核菌丝相互缠绕形成的菌团结构, 不同于常规模式微生物的单一纯系菌落,为了在高假阳性背景的转化平板上获得纯系转化 子,只能通过繁琐的单孢分离过程分离单核孢子,造成遗传改造周期过长;在此基础上的高 表达量菌株的筛选则更加费时费力。
[0007]代谢通路的构建过程、菌种改造过程中通常需要外源基因的成功表达,但是外源 基因产物会由于生物体严谨的控制系统而不能正常形成(CasseltonanddelaFuente Herce, 1989;Ngoepe,2011),造成人力物力资源及时间的浪费,这种无效消耗在丝状真菌的 遗传操作过程中更加严重。
[0008] 因此建立一套检测外源基因表达以及高表达量纯系转化子的快速筛选系统,可以 有效加快丝状真菌的遗传改造进程,促进构建丝状真菌细胞工厂的发展。

【发明内容】

[0009] 本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
[0010] 本发明还有一个目的是提供一种在丝状真菌中成功表达的外源基因的快速筛选 方法,该方法能够对外源基因是否能够在丝状真菌中表达进行快速筛选,比传统的筛选方 法大大缩短了筛选时间,提高了筛选的工作效率,并且通过后期对转化子的复筛,获得高产 量纯系转化子,以适应实际生产的需要。
[0011] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了
[0012] -种重组载体,其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子,所述外源基因位于 启动子的下游,位于终止子或荧光蛋白的上游;所述荧光蛋白位于所述启动子或外源基因 的下游,位于所述终止子的上游。
[0013] 优选的是,其中,所述外源基因为脂酰辅酶A还原酶基因或与脂酰辅酶A还原酶的 氨基酸序列相似性高于80%的脂酰辅酶A衍生物基因,所述启动子为翻译延伸因子1启动子 和丙酮酸激酶启动子;所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。 [0014 ]重组载体在里氏木霉中表达目的蛋白的应用。
[0015]利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法,其特征在于,包括以下步 骤:
[0016] 步骤一、将权利要求1所述的不含外源基因的重组载体转入丝状真菌获得转化子 I;
[0017] 步骤二、将所述转化子I培养产孢,应用流式细胞仪分析转化子孢子I和阴性对照 组获得分析图I和分析图Π,分析图I中沿横坐标排布有孢子群I和孢子群Π,根据分布在分 析图I右侧的孢子群Π的分布范围设定圈定门,在分析图Π中应用所述圈定门圈定孢子群 ΙΠ;
[0018] 步骤三、构建带有丝状真菌启动子、待测外源基因、荧光蛋白表达基因、和终止子 的丝状真菌的转化子Π;以及
[0019] 步骤四、重复步骤二,应用流式细胞仪分析转化子孢子π获得分析图m,应用所述 圈定门在分析图m中圈定范围,当落入所述圈定门内的孢子群IV中孢子数量超过孢子群m 中孢子数量时,判定所述待测外源基因成功表达,当落入圈定门内的孢子群iv中孢子数量 低于孢子群m中孢子数量时,判定所述待测外源基因没有成功表达;
[0020] 其中,所述转化子孢子I为实验组,所述阴性对照组为带有空载体的丝状真菌孢 子,所述丝状真菌的转化子π为待检测组。
[0021] 优选的是,其中,所述步骤二中圈定门的最小值为分析图I中沿横坐标排布的孢子 群I和孢子群Π之间的接触处所对应的分析图I中的横坐标值。
[0022] 优选的是,其中,所述步骤二中应用流式细胞仪分析转化子孢子I和丝状真菌孢子 的具体方法为:设置流式细胞仪的样品压力为20000EPS,利用前向角散射光面积和宽度图, 去除粘连和杂信号;荧光信号使用488nm激光激发,FL1通道分析。
[0023]优选的是,其中,所述转化子的构建方法具体为:
[0024] 7.1)以丝状真菌的基因组DNA和含荧光蛋白表达基因的质粒为模板PCR扩增获得 启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段;
[0025] 7.2)将所述启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段克隆入载体制 备成质粒;以及
[0026] 7.3)制备丝状真菌原生质体,应用所述质粒转化原生质体获得所述转化子。
[0027] 优选的是,其中,所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子;所述 终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。
[0028]优选的是,其中,所述步骤7.2)还包括:在重组酶的作用下,将PCR扩增得到的启动 子、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段组装成Ppki-gfp-TCbh2、Ppki-hph-Tcbh2或 Ptefl-gfp-Tegll的结构克隆到pS頂PLE-19EcoRVBAP载体上;以及将外源待测基因整合 至上述载体gfp的上游位置。
[0029] 优选的是,其中,将分析图m中落入所述圈定门内的孢子群iv中孢子以单孔单孢 的形式,分
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