RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育种中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物育种领域，具体涉及一种RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹 果抗病育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 苹果是我国果树的主栽树种之一，栽培面积和产量均居于世界之首。但是，近年来 随着果树产业的迅速发展和苗木调运的日益频繁，病毒病的传播日益严重。苹果茎痘病毒 (ASPV)是生产中主要的潜隐性病毒之一，植株受到其侵染后树势衰弱，引起产量和果实品 质的下降，部分植株表现为叶片反卷、木质部茎痘斑、果实凹陷等，给果树生产造成严重的 经济损失，目前尚无有效的化学防治方法。
[0003]近年来，苹果生产上通常采用的仍是传统的茎尖脱毒技术，通常包括营养系的初 选、试管苗茎尖培养、热处理脱毒、病毒检测、无毒苗快繁等几个步骤。由于自然条件下病毒 的遗传物质RNA极易发生变异，这就使得已有脱毒苗木在栽培过程中难免还会受到病毒的 再次侵染，难以做到有效脱毒。
[0004]目前，通过基因工程培育抗病毒品种，已成为获得抗病毒植物最为有效的技术途 径，但目前果树植物上通常采用的仍是直接利用病毒外壳蛋白基因进行转化的传统策略， 主要包括以下几个步骤：（l)RT-PCR扩增获得病毒基因的完整序列；（2)将目的基因插入表 达载体，构建含有目的基因的过表达载体;（3)将过表达载体转入根癌农杆菌中；（4)用农杆 菌介导法转化植物获得转基因植株。该传统策略操作繁琐，要求苛刻，安全性尚得不到保 证。
[0005]RNA干扰(RNAi)是近年来发展起来的一种dsRNA介导的高频、高效、高度特异的基 因沉默技术，可通过将外源dsRNA导入细胞介导同源靶基因mRNA序列的降解，抑制靶基因的 表达，是发生在转录后的基因沉默现象。RNAi介导的植物抗病毒基因工程的原理是，利用 RNAi合成与病毒同源的dsRNA，并将其转入植物细胞内，由植物体的RNAi机制对入侵病毒的 RNA进行特异性切割降解，从而保护植物体不受病毒危害。虽然，通过RNA干扰技术沉默病毒 外壳蛋白（CP)基因在某些作物(如大豆、烟草等)上已经获得了良好的抗病毒效果，由于苹 果为多年生木本植物，与草本植物相比，利用基因工程进行抗病育种技术的发展水平明显 滞后，因此在苹果上应用障碍较大，长期得不到实施。
【发明内容】
[0006]针对以上问题，本发明提供一种RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体及其在苹果抗病育 种中的应用，获得的转基因植株具有抗病毒特性，在果树生产中具有良好的应用前景。
[0007]为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现： 一种抗苹果茎痘病毒植株的育种方法，包括以下步骤： (l)RT-PCR扩增获得目的基因片段： 根据病毒基因全长序列，在保守区段设计合成引物;提取感病材料的植物总RNA，通过 反转录获得cDNA第一链，并以此为模板、利用所合成引物进行PCR扩增，获得目的基因片段； 将目的基因片段切胶回收，连接至T载体，测序验证； 优选采用以下步骤： (1.1) 根据Genebank公布的ASPV病毒外壳蛋白基因全长序列，在保守区段设计、合成引 物， ASPV-F:5 '-CACCAGTTGCATTGATTGGGAT-3， ASPV-R:5 '-TCCAATTTTTCCCCCAGTGACT-3 '； (1.2 )用Trizo1法从感病的苹果叶片中提取植物总RNA，取2yg纯化的RNA，在M-MLV反转 录酶作用下，以随机引物OligodT进行反转录合成cDNA第1链，再以此为模板，利用引物 ASPV-F、R以及pfu酶进行PCR扩增，PCR反应程序为:94°C预变性3min; 32个循环的94°C变性 30s、57°C退火 30s、72°C延伸 90s;72°C延伸lOmin; (1.3)将PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，然后将目标条带切胶回收，获得含干扰片 段ASPV的平末端PCR产物，切胶回收后连接至PMD19-T载体，阳性克隆测序。
[0008] (2)RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体的构建： 利用TOPO-Cloning技术构建入门克隆载体，再利用LR反应构建RNAi抗苹果茎痘病毒表 达载体； 优选采用以下步骤： (2.1) 利用TOPO-Cloning技术构建入门克隆载体：取含目的基因片段的PCR回收产物1 yL，构建6yL反应体系：回收目的基因片段ASPVlyL、平衡盐溶液（saltsolution)lyL、 pENTRTM/SD/D_T0P0?载体lyL、灭菌超纯水3yL，25°C反应30min，热激法转化大肠杆菌 T0P10感受态细胞，将转化细胞均匀涂布在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培 养16h后，挑单克隆到含有相同浓度卡那霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养14h，分别 以ASPV-F与ASPV-R和Ml3-F与ASPV-R为引物进行菌液PCR扩增，PCR反应程序为:94°C预变性 3min; 32个循环的94°C变性30s、57°C退火30s、72°C延伸90s; 72°C延伸lOmin;如果扩增片段 的长度明显大于插入片段的长度，即为构建好的入门克隆载体，命名为pENTR-ASPV; (2.2) 利用LR反应构建RNAi干扰载体:取pENTR-ASPV质粒2yL，构建20yLLR反应体系： pENTR-ASPV2yL、pHELLSGATE12 2yL、LRclonaseenzymemix(LR酶）4yL、灭菌水 12yL， 25°C反应12h后加入2yL蛋白酶K，37°C温浴lOmin终止反应;反应产物热激法转化大肠 杆菌T0P10感受态细胞，将转化细胞均匀涂布在含有100mg/L壮观霉素的LB固体培养基上， 37°C培养16h后挑单克隆到含有相同浓度壮观霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养14h 后，分别提取LR反应后的单克隆和pHELLSGATE12空载质粒，先用ASPV-F和ASPV-R作引物进 行菌液PCR，阳性质粒分别用Xbal和Xhol进行单酶切鉴定，将构建好的RNAi抗苹果茎痘病毒 表达载体命名为pH-ASPV; Xbal酶切体系为:XbaIlyL、10XMBuffer2yL、0.1%BSA2yL、LR反应产物6yL、灭菌 超纯水9yL;XhoI酶切体系为:XhoIlyL、10XHBuffer2yL、LR反应产物6yL、灭菌超纯水11 yL〇
[0009](3)将RNAi抗苹果茎痘病毒表达载体转入根癌农杆菌： 用冻融交替法转化农杆菌菌株，转化后进行阳性克隆的筛选鉴定； 优选采用以下步骤： (3.1) 用冻融交替法转化农杆菌菌株:用冻融交替法将质粒pH-ASPV转化农杆菌EHA105 感受态细胞，均匀涂布在含有100mg/LSpc和50mg/L利福平的YEB平板培养基上，28°C倒置 培养2d，挑单克隆到含有相同浓度的壮观霉素和利福平的YEB液体培养基中，28°C条件下震 荡培养48h; (3.2) 转化后阳性克隆的筛选鉴定:将pH-ASPV质粒转化农杆菌菌株EHA105后，分别用 ASPV-F与ASPV-R、P35S-F与ASPV-R以及ΝΡΤΠ-F与ΝΡΤΠ-R作引物进行菌液PCR扩增，如果用 ASPV-F与ASPV-R作引物PCR扩增出现493bp大小的片段，而以P35S-F与ASPV-R作引物的扩增 片段明显大于干扰片段大小，且以ΝΡΤΠ-F与ΝΡΤΠ-R作引物扩增片段大小为714bp，说明 RNAi载体已成功转入农杆菌中，即为可用于侵染植物的RNAi工程菌，命名为EH-ASPV。
[0010] (4)苹果叶盘受体材料的无菌培养： 采集田间材料，并进行消毒处理，再进行无菌营养的继代培养，以及叶盘的切割与预培 养； 具体包括以下步骤： 4月份采集当年生幼嫩苹果枝条，用流水冲洗2~4h，剪成约1.0~2.0cm长的茎段，先 用75%的酒精进行表面消毒，0.l%HgCl2水溶液浸泡lOmin，无菌水漂洗4~5次，接种在MS+6-BAO. 5mg//L培养基上，每4~5周继代1次;取继代培养15~20d的M26无菌苗，无菌条件下将顶 部幼嫩叶片从中部划伤成部分连在一起的叶盘，在MS+6-BA4.Omg/L+NAAO. 2mg//L培养基上 进行预培养。
[0011] (5)用农杆菌介导法转化苹果获得转基因材料： 培养RNAi工程菌，将根癌农杆菌侵染苹果叶盘，然后，进行Kan抗性芽的筛选、继代培 养； 具体包括以下步骤： 将上一步骤中的苹果叶盘在MS+6-BA4.Omg/L+NAAO. 2mg//L培养基上预培养2天后，将EH-ASPV菌液28°C震荡培养至0D=0.5，6000rpm离心lOmin后收集沉淀的菌体，用等体积的MS 液体培养基重悬菌液，浸泡侵染叶盘10min后，用无菌滤纸吸干多余的菌液，接种在1^+6_ BA4 ·Omg/L+NAAO· 2mg/L培养基上暗培养 3d，转至MS+6-BA4 ·Omg/L+NAAO· 2mg/L+Cef250mg/L 培养基上进行脱菌培养，7d后转至MS+6-BA4 ·Omg/L+NAAO· 2mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L 培养基上进行筛选培养，切取获得的抗性芽接种在MS+6-BA0 · 5mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/ L培养基上，每2周继代一次，连续继代3次后，将发育良好的抗性芽转至1/2MS+NAA0.2+ Kan50mg/L+Cef250mg/L培养基中进行生根培养。
[0012] (6)转基因植株的检测： 对所得转基因植株进行PCR初检，然后进行Southern杂交检测； 具体包括以下步骤： (6.1) PCR检测:选取生根良好的Kan抗性植株，用CTAB法提取植物基因组DNA，用ASPV-F与ASPV-R作引物进行PCR扩增，在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析； (6.2)Southern杂交检测:选取PCR检测为阳性的植株进行Southern杂交，具体步骤为： (6.2.1)探针制备 采用PCR制备探针，PCR反应体系为：10Xbuffer(含Mg2+ 15mmol/L) 5yL，dUTP标记混 合物5yL，NPTII-FlyL，NPTII-RlyL，Taq酶lyL，阳性质粒lyL，双蒸水36μΙ^ΡΟ?反应参数 为：94°C预变性5min;94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸40s，共35个循环；72°C延伸lOmin； (6.2.2) 对基因组DNA和阳性质粒进行酶切 基因组DNA酶切体系如下：10XMbuffer60yL，内切酶HindIII，30yL，基因组DNA10μ L，灭菌水加至总体积为600yL;酶切后的DNA用等体积酚：氯仿抽提，产物溶于50yL去离子 水;质粒酶切体系为：10XMbuffer5yL，内切酶HindIII2.5yL，阳性质粒2.5yg，灭菌水 加至总体积为50y