基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类非病毒基因转染的载体及其制备方法，具体是涉及一种基于聚乙 烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肝癌是恶性程度极高的肿瘤，每年新发病例55.4万，而死亡病例也高达52.1万。肝 癌治疗效果不佳、预后不良已成公认的临床治疗难题之一，这可能和肝癌复杂的恶性增殖 机制有关，而miRNA表达突变是其中极其重要的调节机制。miRNA是一类长度为20-24个核苷 酸的非编码RNA，作用于转录后基因调节。研究表明，部分关键miRNA通过调节癌基因表达和 肿瘤信号通路来抑制恶性肿瘤的生长，多种恶性肿瘤中这些miRNA的调节通路出现异常变 化，介导肿瘤的免疫逃逸和疾病的快速进展。miRNA在肝癌的发生和转移过程中发挥着非常 重要的作用，肝癌中的111丨1?-16、111丨1?-343、111丨1?-1993、111丨1?-139等111丨1?祖表达水平明显下调，而 miR-21、miR-92a、miR-126、miR-122、miR-223 等miRNA表达水平却上调，形成了复杂的miRNA 调控网络，涉及到线粒体介导的凋亡通路、细胞周期检查点、受体酪氨酸激酶通路等。
[0003] miR-34a是miRNA调控网络中极其重要的一个节点，主要有阻滞细胞周期、促进细 胞衰老、诱导细胞凋亡、阻止细胞迀移等生理功能。miR-34a直接受上游p53的调节，正常生 理环境中，DNA损伤激活的p53基因，与miR-34a启动子结合并上调miRNA的表达;在肝癌病理 环境中，P53保守DNA结合序列中CpG岛被甲基化，阻碍了p53对miR-34a的激活，从而抑制了 上调miR-34a的正常生理过程。在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中，miR-34a表达偏低或缺 失。
[0004] 经研究发现，有许多miRNA参与了肝癌发生和转移的调节网络，而且一些miRNA被 证明可以用于肝癌的临床治疗，miR-34a就是其中的主要代表分子，其具有重要的临床应用 前景。miR-34a替代疗法通过输送miR-34a至肝癌细胞内，恢复胞内的miR-34a表达水平，从 而逆转病理情况下因P53突变导致的miR-34a表达缺失，达到负性调节肝癌细胞增殖及转移 的目的。miR-34a基因疗法中有2点必不可少：（1)基因载体，裸miRNA基本不可能在体内复杂 的生理环境中（如循环和组织屏障、内吞后的溶酶体分解作用等)到达肝癌细胞内产生抗肿 瘤作用，需要通过合适的基因载体协助才能达到满意的药代动力学和转染效率，来发挥治 疗效果；（2)运载功能性(如肝癌革E1向性、控释能力等），缺少革E1向性会导致高表达miR-34a损 伤正常细胞的情况，对肝癌细胞的高度特异性转染可最大程度减少此类不良反应的发生 率，而缺乏控释作用可导致基因在体内循环运输过程中提前释放，造成靶器官内生物利用 度降低和循环中游离基因药物的不良反应。MirnaTherapeutics公司基于miR-34a研发了 一种名为MRX34的基因药物，以脂质体介导miR-34a对肝癌的转染，目前正在进行I期临床试 验[15] 〇MRX34通过静脉给药，抑制24种已知的肝癌相关基因来治疗肝癌，但同时其靶向性 的缺失导致了正常细胞中的外源性miR-34a过表达，产生脱靶的不良反应，这也正是目前临 床应用载体介导的miR-34a治疗过程中亟需解决的问题。因此，研发一种同时具有高效转染 能力、敏感控释和肝癌靶向性的基因药物运载系统就非常有必要。
[0005] 近年来，随着功能性纳米材料研究的逐渐深入，借助纳米技术可以解决多种临床 问题，特别是作为基因载体的纳米微粒研究日趋成熟，通过功能性纳米载药系统来改进基 因的释药方式、体内分布、不良反应，也变得更加简单易行。在抗肿瘤基因治疗中，纳米技术 带来的功能性运载具有重要的临床意义。基因载体功能性主要体现在：（1)应激控释能力； (2)以材料可降解性为主要特点的生物相容性；（3)肿瘤靶向性[16]。针对肝癌的miR-34a替 代疗法迫切需要的正是此类功能性基因载体。
[0006] 纳米材料的应激控释能力可使载体在某些特定的刺激因素作用下调控基因药物 的释放，肿瘤微环境中的刺激因素包括pH改变、温度改变、氧化还原刺激、光刺激等。纳米载 体的应激敏感性通常与其分子结构的特殊性密切相关。温度敏感性常和低临界溶解温度 (LCST)下的分子构象改变有关，pH敏感载药系统多含有酸或碱反应性的化学键。氧化还原 敏感性一般通过二硫键结构得以实现，载药系统在外界环境改变产生氧化还原刺激后，内 部二硫键逐渐断裂，系统内纳米结构被破坏，药物释放速率获得调控。
[0007] 现有技术人员一直进行氧化还原敏感型控释系统的研发:基于具有氧化还原敏感 性的二硫键，构建了高分子载药颗粒核心和表面聚乙二醇(PEG)保护壳，载药并加入核酸 后，带有负电的核酸和PEG壳通过静电作用结合，压缩高分子载药颗粒核心，完成药物的包 封过程。在溶酶体环境的还原酶催化下，二硫键断裂导致PEG壳/核酸复合体自高分子纳米 颗粒表面脱落，药物释放速率增加。氧化还原敏感性可以保证基因运载系统在肿瘤细胞中 因溶酶体的氧化还原刺激而释放miRNA，而在系统循环中几乎不释放基因，大大减少了基因 治疗的全身毒副作用，并且保证了较高的生物利用度。
[0008] 基因运载靶向性也是目前需要着重解决的问题。国内外许多研究人员已在靶向性 上进行了大量的研究，通过多种方法构建、筛选了用于基因或药物运载系统的靶向基团。 CityofHope癌症中心的MarkDavis教授通过在纳米材料上修饰革E1向基团来促进治疗革巴 标对载药纳米颗粒的吸收和利用，使得载药系统携带的基因能够特异性地作用于肿瘤细 胞，并首先在体内研究中证明了其有效性。
[0009] 精胺及衍生物桥连的环糊精可形成具有规整交替结构的聚阳离子纳米材料，以聚 阳离子材料为基础合成了多种高效转染的基因载体，并且进一步通过主客体组装技术，对 原始基因载体进行功能化修饰。
[001 0]目前的问题在于，如何进一步改善优化载体材料，使其具有高效、靶向的基因药物 输送能力，可以实现miR-34a替代疗法所需要的多功能性运载，以破解现有miR-34a疗法中 的基因运载难题。
【发明内容】
[0011]为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明目的是提供一种基于聚乙烯亚胺-环糊 精的多功能超分子基因运载系统及其制备方法，可用于新型的非病毒基因治疗。本发明在 含环糊精的聚阳离子纳米材料上，通过主客体组装技术修饰含有靶向基团的功能化客体， 并在客体中导入氧化还原敏感的二硫键，最终可形成具有氧化还原敏感性、肝癌靶向性、主 客体自组装的、高效基因转染的多功能基因载体，能够携带治疗基因高效治疗肝脏恶性肿 瘤。
[0012] 本发明采用的技术方案如下：
[0013] 一、一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统：
[0014] 主要由主体聚乙烯亚胺-环糊精以及分别装载在主体聚乙烯亚胺-环糊精上的客 体金刚烷-二硫键-聚乙二醇和客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽而形成的复合物。
[0015] 所述复合物的具体结构式如下：
[0017] 其中，m、n2、n3分别代表主体聚乙烯亚胺-环糊精单元个数、与客体金刚烷-二硫 键-聚乙二醇自组装的聚乙烯亚胺-环糊精单元个数、与客体金刚烷-聚乙二醇-靶向肽自组 装的聚乙烯亚胺-环糊精单元个数，别代表金刚烷-二硫键-聚乙二醇中聚乙二醇单 元个数和金刚烷-聚乙二醇-靶向肽中聚乙二醇单元个数，X1、yi分别代表主体聚乙烯亚胺-环糊精中伯氨基单元数量和仲氨基单元数量，x2、y2分别代表客体金刚烷-二硫键-聚乙二醇 中聚乙烯亚胺的伯氨基单元数量和仲氨基单元数量，X3、y3分别代表客体金刚烷-聚乙二醇-革巴向肽中聚乙稀亚胺的伯氨基单元数量和仲氨基单元数量;m、n2、n3、mi、m2、xi、X2、X3、yi、 y2、y3均为大于0的整数。
[0018] 本发明复合物所形成分子的分子量大约在10000-20000左右。
[0019] 所述的主体聚乙烯亚胺-环糊精是由环糊精与聚乙烯亚胺反应得到，所述的客体 金刚烷-二硫键-聚乙二醇是由金刚烷通过二硫键与聚乙二醇结合制备得到。
[0020] 所述的金刚烷-聚乙二醇-靶向肽是由金刚烷甲酸和聚乙二醇反应后再结合靶向 肽制备得到。
[0021] 二、一种基于聚乙烯亚胺-环糊精的多功能超分子基因运载系统的制备方法：
[0022] 由环糊精与聚乙烯亚胺反应得到聚乙烯亚胺-环糊精，由金刚烷通过二硫键与聚 乙二醇结合制备得到金刚烷-二硫键-聚乙二醇，由金刚烷甲酸和聚乙二醇反应后再结合靶 向肽形成金刚烷-聚乙二醇-靶向肽，再将三者按照1:0.5-2:0.5-2