一种酶法再生atp的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物化工领域，特别涉及一种酶法再生ATP的方法。
【背景技术】
[0002] ATP是生物体内最重要的高能磷酸化合物，在医学上被广泛用作肌肉萎缩、心肌梗 塞、肝炎和各种急救病症中的治疗或重要辅助治疗药物。工业上也有许多重要的生物活性 物质或生化药物的生物合成过程，也都是需要ATP参加的酶促反应。所以，ATP的生产以及工 业上ATP的循环再生成为酶工程发展的一个重要问题，是决定工业生产是否经济节约的关 键因素。
[0003]近年来，对ATP再生的研究主要在多聚磷酸激酶催化法，即以ADP和多聚磷酸为底 物，由多聚磷酸激酶催化产生ATP。对于不同来源的多聚磷酸激酶，催化特点各不相同。如 Thermotoga11^1'；[1:;[1]^来源的多聚磷酸激酶16?口1^是一种嗜热酶，它的最适温度为70度，适 合参与温度较高的反应，但在多数常温酶的最适温度(30~37度)条件下酶活较低，不能与 常温酶的耦合反应，因此不能广泛的满足工业生产需求。还有一些多聚磷酸激酶，虽然最适 温度在30度左右，但是利用的多聚磷酸盐聚合度较高，这种聚合度高的聚磷酸盐在当前在 市场上不易得到而且价格昂，这就提高了生产难度和生产成本。另一方面，就工业大量生产 ATP而言，一些多聚磷酸激酶会受到多聚磷酸盐的抑制，所以大规模生产时不得不采用流加 多聚磷酸盐的方法来减少抑制，使生产过程变得繁琐。所以现在亟需找到一种合适的多聚 磷酸激酶，使它既能与许多常温酶耦合参与工业生产，又能够使用比较常见且价格低廉的 多聚磷酸盐为磷酸供体，使ATP再生过程方便、廉价、高效。
[0004] 与公知技术相比，本发明具有以下优点：
[0005] 1)反应最适温度为30~37度，符合工业生产上多数常温酶的温度要求，应用范围 广泛。
[0006] 2)磷酸供体为低聚合度的多聚磷酸盐，相比聚合度为65或者更高聚合度的多聚磷 酸盐，这些低聚合度的多磷酸盐价格低廉且常见易得，使ATP再生过程经济、方便。
[0007] 3)没有聚磷酸盐抑制现象，能在较高浓度的多聚磷酸底物作用下高效生产ATP。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种异源表达的聚磷酸激酶，以低聚合度的多聚磷酸盐为 磷酸供体，在聚磷酸激酶的催化条件下生成ATP，为多种消耗ATP的酶促反应源源不断的提 供能量。
[0009] 本发明首先构建基因工程菌，异源表达来自谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶基 因。即将基因ppk克隆至原核表达载体pET28a中得到多聚磷酸激酶基因表达载体pET28a-ppk。然后将表达载体转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，IPTG诱导表达，即可在胞内获得多聚磷酸 激酶。
[0010] 蛋白表达后，通过超声破碎将大肠杆菌中的多聚磷酸激酶释放出来，获得粗酶液。 在三聚磷酸、四聚磷酸或者六偏磷酸或其钠盐为磷酸供体的条件下，以ADP为底物粗酶液催 化产生ATP。
[0011]本发明提供的方法，以ADP为底物，利用价格低廉的三聚磷酸、四聚磷酸和六偏磷 酸为磷酸供体，异源表达多聚磷酸激酶催化产生ATP，为经济高效生产ATP并在此基础上降 低多种酶促反应的成本提供了一种创造性的方法。
[0012]图1:DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为多聚磷酸激酶基因ppk的PCR产物，右侧为DNA大 小标准品。
[0013] 图2:pET28a-ppk质粒图谱，将ppk基因克隆到pET28a载体上，基因的两端有Ncol和 EcoRI酶切位点。
[0014] 图3:诱导表达多聚磷酸激酶PPK蛋白电泳图。泳道1为pET28a空质粒表达后破胞上 清，泳道2为PPK酶表达后破胞上清。
[0015] 图4:谷氨酸棒状杆菌来源的多聚磷酸激酶动力学参数曲线
[0016] 图5:嗜热链球菌来源的谷胱甘肽合成双功能酶以PPK催化生成的ATP为能源酶促 产生谷胱甘肽的反应体系。30禮反应体系中分别添加5111]\1、1〇111]\1、15111]\1、2〇1111、3〇1111八了？时，各 时段的转化率对比。"l〇hGS"为30mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源添加的ATP提供能 量，反应l〇h后取样检测得到的转化率。"22hGS"为30mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源 添加的ATP提供能量，反应22h后取样检测得到的转化率。"10hGS+PPK"为30mM反应体系中 加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶重生的ATP提供能量，并在反应10h后取样检测的转 化率。"22hGS+PPK"为30mM反应体系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶再生的ATP 提供能量，并在反应22h后取样检测的转化率。
[0017] 图6:酶促反应生成3-磷酸甘油的实验组和对照组的反应进程对比
[0018] 图7:酶促反应生成N-乙酰氨基糖胺的实验组和对照组反应进程对比
【具体实施方式】
[0019] 1.克隆谷氨酸棒状杆菌中ppk多聚磷酸激酶基因。
[0020] 2.谷氨酸棒状杆菌中ppk聚磷酸激酶基因重组载体构建。
[0021] 3.诱导表达多聚磷酸激酶PPK。将构建好的重组表达载体pET28a-ppk质粒转入大 肠杆菌感受态细胞E.coliBL21(DE3)，在IPTG作用下诱导表达。
[0022] 4.超声破碎表达菌体，提取粗酶液进行反应。合成反应中的酶添加量采用考马斯 壳监测蛋白法进行标定。
[0023] 5.酶法合成ATP。在Tris-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg2+存在下，以ADP为底物，多聚 磷酸盐为磷酸供体，通过多聚磷酸激酶PPK合成ATP。
[0024] 6.比色法测定NADPIPPK酶反应生成的ATP在己糖激酶作用下与葡萄糖反应生成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖参与6-磷酸葡萄糖脱氢酶的催化反应，使NADP转化成NADPH。 用紫外分光光度计在340nm测NADPH处吸光度，NADPH的摩尔吸系数为6.22L/(mmol·cm)，根 据摩尔吸光系数计算生成的NADPH的量。通过测定NADPH的量间接检测PPK催化生成的ATP的 量。
[0025] 7.酶法合成谷胱甘肽。在Tris-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg2+存在下，以谷氨酸、甘 氨酸和半胱氨酸为底物，六偏磷酸盐为磷酸供体，通过嗜热链球菌来源的谷胱甘肽合成双 功能酶(GS)和谷氨酸棒状杆菌来源的多聚磷酸激酶(PPK)合成谷胱甘肽。
[0026] 8.谷胱甘肽的检测。采用四氧嘧啶法测定反应液中GSH的含量，在pH 7.2的缓冲条 件下，反应产物与四氧啼啶结合，20min后测定结合物在305nm下的吸光度值。由GSH标准曲 线计算出样品中GSH的含量。
[0027] 9.酶催化生成3-磷酸甘油。实验以ADP和甘油为底物，通过PPK酶对ATP的再生为3- 磷酸甘油的产生提供能量，使甘油在甘油激酶的催化作用下生成3-磷酸甘油。用IonPac AS19高容量分离柱和氢氧化钾梯度洗脱，3-磷酸甘油二钠的保留时间为16.8min。通过检测 3_磷酸甘油二钠的量间接反映PPK酶再生ATP的能力。
[0028] 10.酶催化产生N-乙酰氨基糖胺。在Tris-HCl缓冲体系中加入Mn2+和Mg2+作为辅因 子，首先UDP由PPK酶催化形成UTP，UTP与1-磷酸-a-D葡萄糖为UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的底 物，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的UDP葡萄糖再由UDP-葡萄糖4-位差向异构酶异构化， 然后半乳糖基转移酶催化产生N-乙酰氨基葡萄糖。用有机酸柱和示差检测器检测N-乙酰氨 基葡萄糖的含量，柱温设定为65度，检测器温度为40度，5mM硫酸为流动相，流速为0.5ml/ min，N-乙酰氨基葡萄糖的保留时间为lOmin。实验通过检测N-乙酰氨基葡萄糖的量来反映 PPK酶催化NDP生成NTP的能力。
[0029]下面结合实施例对本发明具体方法进一步说明：
[0030] 实施例1
[0031] 1.1谷氨酸棒状杆菌菌株中ppk聚磷酸激酶基因的克隆与重组载体构建
[0032]利用基因组扩增的方法合成谷氨酸棒状杆菌菌株中ppk聚磷酸激酶基因。以该菌 株全基因组为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点(Ncol和EcoRI)与 保护碱基。
[0033] PCR扩增多聚磷酸激酶基因ppk所用引物如下：
[0034]上游引物：5 '-GCATATGATGACCGCCACCGATTC-3'
[0035]下游引物：5 '-GAAGCTTCCGGTTGGTAGCTGTGAC-3'
[0036] PCR体系反应体系含有0.2yL基因组DNA，上下游引物各0.5yL，Extaq混合液10yL， 加双蒸水补至20yL。反应条件为预变性94°C5min，变性94°C30s，退火55°C30s，延伸72°C lmin，循环30次，72°C10min，4°C保存。这样即可克隆扩增到目的多聚磷酸激酶基因ppk，核 酸电泳图见图1，显示1 〇48bp处为ppk基因片段。
[0037] 1.2重组载体质粒的构建
[0038] 将克隆的PPK基因与pET28a载体(购于Novagen公司）分别用内切酶(Ncol和EcoRI) 进行双酶切，37°C酶切3h，载体与外源基因片段按摩尔比1:3的比例，利用NEB的T4DNA连接 酶16°C连接过夜，用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布于带有卡那霉素抗性 LB琼脂平