一种高通量筛选啤酒酵母的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量筛选啤酒酵母的方法。
【背景技术】
[0002] 高通量筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平 的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵 敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以 千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系。目前该技术在国外已经相对成 熟，随着科技的发展，多种全自动高通量筛选系统相继出现。自动高通量筛选系统可以自动 连续的进行培养基灭菌，倒平板，挑取单菌落，分装发酵培养基，接种，抽提，液相分析和数 据自动收集处理等过程。但目前我国的高通量微生物筛选研究才刚刚起步，开展的高通量 筛选技术大多都是应用于动物细胞培养或单细胞微好氧的微生物培养。相对传统的摇瓶筛 选，HTS技术具有微量、快速、灵敏、准确和操作方便等优点。
[0003]在啤酒酿造过程中，最初双乙酰被认为是啤酒中污染的乳酸菌所产生的，直到20 世纪60年代，人们才发现双乙酰是酵母正常的中间代谢物。这一发现对于在啤酒酿造过程 中对双乙酰的调控起到了至关重要的作用。啤酒中的双乙酰不仅是影响啤酒风味的重要因 素，而且还是衡量啤酒成熟的主要依据。它具有挥发性和强烈的刺激性，当其含量过高时 (淡色啤酒中2 1.5mg/L)，啤酒会呈现出馊饭味，严重破坏啤酒的风味，并影响啤酒的感官 质量。国家标准中优级淡色啤酒要求双乙酰含量在〇.13mg/L以下。传统的啤酒酿造过程中， 啤酒酵母产生的双乙酰在发酵后期和贮酒期由酵母重新吸收还原成丁二醇。但在后发酵和 贮酒过程中，酵母数量少，且还原双乙酰的速度慢，造成双乙酰还原周期长。所以在啤酒酿 造过程中，双乙酰含量控制方法的好坏是影响啤酒酿造周期的主要因素之一。
[0004] 啤酒酵母作为影响啤酒生产的众多因素之一，在啤酒生产中起着至关重要的作 用。但由于酵母易受外界条件的影响而发生变异、衰老、混杂，因此要保持酵母菌种的纯粹 和强壮，对其进行筛选就成为啤酒厂非常重要而且是经常性的工作。啤酒厂应该根据自身 的生产情况和产品特点，选择理想的酵母纯菌株。酵母菌株的选育工作在啤酒的发酵生产 中必不可少。无论是用传统诱变、用现代基因工程手段对缩短发酵周期酵母菌株的改造，还 是菌株的复壮，都需要从众多的单菌株中挑选，而目前常用的筛选方法，都是先从特定的平 板上挑选单菌落，然后通过试管或小摇瓶发酵进行初筛，再用量筒(EBC管)进行复筛。由于 摇瓶初筛操作简单，但是工作量大，同时人为误差也大，并且每次筛选数量有限，筛选工作 速度慢，因此，需要建立一套属于啤酒酵母菌株的高通量筛选模型。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种选育目的啤酒酵母的方法。
[0006] 本发明提供的选育目的啤酒酵母的方法包括如下步骤:将η个啤酒酵母分别接种 于含有麦汁培养基的微孔细胞培养板的各孔中，培养，检测培养后孔中η个啤酒酵母的0D 值，根据所述培养后孔中η个啤酒酵母的0D值选育目的啤酒酵母；
[0007]η为大于等于4的正整数。
[0008]上述方法中，所述微孔细胞培养板为96孔细胞培养板。
[0009]上述方法中，
[0010] 所述培养的时间为l〇-12h;
[0011] 所述培养的时间具体为llh。
[0012] 上述方法中，
[0013]所述培养的温度为29-31°C。
[0014] 所述培养的温度具体为30°C。
[0015] 上述方法中，所述啤酒酵母在所述麦汁培养基中的接种浓度为10X106个/ml。
[0016] 上述方法中，根据培养后孔中η个啤酒酵母的0D值选育目的啤酒酵母为选取波长 600nm条件下0D值在0 · 9-1 · 6的啤酒酵母。
[0017] 上述方法中，所述η个啤酒酵母为8902、68obg、0002和0.K. 3。
[0018] 上述方法中，所述麦汁琼脂培养基的制备方法:在液体麦汁培养基中加2 %的琼脂 粉。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种培养啤酒酵母的方法。
[0020] 本发明提供的培养啤酒酵母的方法包括如下步骤:将啤酒酵母接种到含有麦汁培 养基的微孔细胞培养板中，培养。
[0021] 上述方法中，
[0022 ]所述培养的时间为10-12h，所述培养的时间具体为1lh;
[0023] 所述培养的温度为29_31°C，所述培养的温度具体为30°C;
[0024] 所述啤酒酵母在所述麦汁培养基中的浓度为10X106个/ml;
[0025] 所述微孔细胞培养板为96孔细胞培养板。
[0026] 本发明的最后一个目的是提供上述方法的新用途。
[0027] 本发明提供了上述方法在选育目的啤酒酵母中的应用。
[0028] 本发明对传统的啤酒酵母筛选方法进行了改良，用微孔细胞培养板代替试管或摇 瓶进行筛选，一块微孔细胞培养板就可以同时对多个样品进行摇床发酵，摇床上可放置多 个微孔培养板，作为本发明待筛选原料可以是分离自自然界的初筛产物，也可以是人工诱 变的产物，例如紫外诱变。本发明的方法有效的增加了每次筛选的菌落数量，降低了筛选工 作强度，提高了整个筛选工作的效率，对啤酒酵母菌株的选育有积极的作用。
【附图说明】
[0029]图1为吸光度平均值验证试验曲线图。
[0030]图2为发酵C〇2失重曲线图。
【具体实施方式】
[0031 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 下述实施例中的麦汁培养基的制备方法:将麦汁(燕京啤酒股份有限公司）经灭菌 处理后得到的。
[0034]下述实施例中的麦汁琼脂培养基的制备方法:在液体麦汁培养基中加2%的琼脂 粉。
[0035] 下述实施例中的啤酒酵母菌株8902的保藏号为CGMCCNo. 1784。
[0036] 下述实施例中的啤酒酵母菌株0002的保藏号为CGMCCNo. 10572。
[0037]下述实施例中的啤酒酵母菌株68obg是德国柏林啤酒酿造学院的产品，产品编号： 016 719〇
[0038]下述实施例中的啤酒酵母菌株O.K.3是德国柏林啤酒酿造学院的产品，产品编号： 016 720〇
[0039]实施例1、啤酒酵母培养参数的优化
[0040] -、参数优化
[0041 ] 1、菌种的处理
[0042]将待筛选的啤酒酵母菌株(8902CGMCCNo. 1784)进行活化扩培，得到活化后培养 的菌悬液，其具体步骤如下：
[0043] (1)将保存于斜面的菌株用接种环接取一环加入装有10mL12°P麦汁培养基的试管 中，于25 ± 1°C培养24小时。
[0044] (2)将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀，用无菌吸管接lmL加入装有10mL12°P 麦汁培养基的试管，振荡均匀后于25 ± 1°C培养24小时。
[0045] (3)将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀后，全部接入装有100mL12°P麦汁培养 基的小三角瓶，振荡均匀后于25 ±1°C培养24小时。
[0046] (4)将培养结束的小三角瓶轻轻振荡均匀后，全部接入装有1000mL12°P麦汁培养 基的大三角瓶，然后静置于25 ± 1°C培养48小时。
[0047] (5)将大三角瓶中上层菌悬液倾倒掉，取适量底部酵母泥于200mll2°P麦汁复溶， 酵母计数，取适量酵母悬液至2L12°P麦汁培养基中（酵母接种量控制在12~15X106个/mL左右）。
[0048] 2、筛选最优培养条件
[0049]将步骤1获得的活化后的菌悬液，根据筛选所需工艺参数(包括筛板孔数、培养温 度、培养时间和酵母