用于检测人类pdgfra基因d842v突变的引物、探针及试剂盒的制作方法

文档序号:9703148阅读:1167来源:国知局
用于检测人类pdgfra基因d842v突变的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种用于检测人类TOGFRA基因D842V突变 的引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 胃肠间质瘤(gastrointestinalstromltumor,GIST)是胃肠道最常见的间叶源 性肿瘤,其发病率有逐年增高的趋势。主要发生于胃肠道、大网膜和肠系膜,占所有胃肠道 肿瘤的0.2 %,占胃肠道肉瘤的80 %,C-kit受体(又称⑶117)基因通常呈阳性表达。对绝大 多数患者来说,基因突变是肿瘤形成的关键,其中CKIT基因突变占80-85%,PDGFRa突变占 7%,野生型(未检测到突变)占10-15%XIST患者手术切除后容易复发,中位复发时间约为 2年,仅有10 %的患者长期随访未见复发。
[0003]血小板衍生生长因子受体(Platelet-derivedGrowthFactorReceptors, roGFR)是一种调节细胞生长的跨膜蛋白,属于III型酪氨酸激酶家族,主要分布于平滑肌细 胞,内皮组织细胞、成纤维细胞和胶质细胞。PDGFR在调节细胞增殖、分化和新血管形成等方 面发挥重要调节作用。PDGFR通过与信号分子结合后形成受体配体复合物并活化PDGFR,进 而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信号通路,通过各种信号转导通路将有丝分 裂等信号传递入细胞核,诱导相应基因表达,进而调节肿瘤细胞的分裂和增殖。
[0004]甲磺酸伊马替尼(格列卫)是一种分子靶向药物,用于治疗不能切除或发生转移的 恶性胃肠道间质肿瘤,在GIST的治疗中取得了非常好的疗效。目前,对于术后复发或转移的 GIST患者,如果存在高危因素或不能进行手术治疗,甲磺酸伊马替尼(格列卫)是标准的一 线药物,当格列卫用药过程中不能耐受,或出现疾病广泛进展(generalizedprogression) 时,二线药物应用苹果酸舒尼替尼(索坦)。
[0005] 有研究表明,携带有TOGFRA基因D842V突变的GIST患者对伊马替尼耐药。在一项对 携带TOGFRA突变的GIST患者的生存结局进行报道的国际调查中,在D842V突变的31例可评 估患者中无一例获得疾病应答(imatinib),21例(68%)发生疾病进展。
[0006]目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的 方法灵敏度低,检测灵敏度只有20-30%;实验操作复杂,检测效率低、样品易污染,通常要 1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测,直接测序的方法几乎无法实现其准确检 测,会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法,都无法 有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂,且容易污染,假阳性率高。

【发明内容】

[0007]为了解决现有检测技术出现的灵敏度低、检测时间长、检测效率低、样本易污染、 假阳性率高等问题,本发明提供了用于检测人类roGFRA基因D842V突变的引物和探针,灵敏 度高,特异性强,有效避免假阳性。本发明还提供了包括上述引物和探针的试剂盒,检测方 便快速,操作简单,结果易读,适用范围广。
[0008] 本发明提供的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针,核苷酸序列如 下:
[0009] 突变上游ARMS引物PM1-F:SEQIDN0:1,
[0010] 突变下游引物PW1-R:SEQIDN0:2,
[0011]检测探针pw卜P:SEQIDN0:3,
[0012] 阻断探针PW1-B:SEQIDN0:4;
[0013] 其中,检测探针核苷酸序列5'端标记有荧光基团,3'端标记有淬灭基团;阻断探针 的核苷酸序列5 '端经过双脱氧修饰,3 '端标记有淬灭基团。
[0014] 表1:PDGFRA基因D842V热点突变
[0016] 上述引物和探针是针对表1中位点突变设计的特异性检测引物,其中,PM1-F为突 变上游ARMS引物,与D842V(2525A>T)位点突变序列特异性结合,选择性扩增突变序列;PW1-R为突变下游引物,与TOGFRA基因保守序列结合;PW1-P为5 '端标记有FAM信号3 '端标记MGB 的检测探针,能与扩增片段结合;PW1-B为5'端双脱氧修饰3'端MGB标记的阻断探针,能与 D842V位点野生型序列特异性结合,抑制野生型非特异扩增。
[0017] 优选地,上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针,所述荧光基团为 FAM,所述淬灭基团为MGB。MGB(MinorGrooveBinder)基团可与DNA螺旋小沟结合,进而提 高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10°C)。相对于普通TaqMan探针,MGB探针 序列可设计得更短,特异性更强。
[0018] 本发明提供的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒,包括以上任一所述 的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针。
[0019]优选地,所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒,还包括外控引物和探 针,核苷酸序列如下:
[0020] 外控上游引物PR-F:SEQIDN0:5,
[0021] 外控下游引物PR-R:SEQIDN0:6,
[0022] 外控检测探针PR-P:SEQIDNO:7,外控检测探针核苷酸序列的5'端标记有FAM,3' 端标记有MGB。
[0023] 其中,PR-F和PR-R为外控上下游引物,扩增TOGFRA基因保守序列;PR-P为5 '端标记 有FAM信号3 '端标记MGB的检测探针,能与扩增片段结合。
[0024] 优选地,所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒,还包括内控引物和探 针,核苷酸序列如下:
[0025] 内控上游引物IC-F:SEQIDN0:8,
[0026] 内控下游引物IC-R:SEQIDNO:9,
[0027] 内控检测探针IC-P:SEQIDNO: 10,内控检测探针核苷酸序列的5'端标记有JOE, 3'端标记有BHQ1。
[0028] 其中,IC-F和IC-R为内控上下游引物,扩增matK基因保守序列;IC-P为5'端标记有J0E信号3 '端标记BHQ1的检测探针,能与扩增片段结合。
[0029] 优选地,所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒,还包括阳性对照品和 内控品,阳性对照品包括含有发生2525A>T碱基变化的PDGFRA基因片段〉gi|568815594: 54285801-54286200的阳性质粒,含有H)GFRA基因保守序列〉gi| 568815594: 54288901-54289300段碱基的外控质粒,含有matK基因保守序列〉gi| 11994090:c2400-2001段碱基的 内控质粒;内控品为含有matK基因保守序列〉gi|ll994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。
[0030] 优选地,所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒,试剂盒中的反应体系 分为两种:
[0031]检测反应体系:包括用于检测人类roGFRA基因D842V突变的引物和探针,内控引物 和探针,ABpremix,10Xbuffer和ddH2〇;
[0032] 质控反应体系:包括外控引物和探针,内控引物和探针,ABpremix,10Xbuffer和 ddH20;
[0033] 所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品TaqjVltin1'FastAdvaneed MasterMix;所述10Xbuffer为10倍浓度的缓冲液,缓冲液中含有Mg2+。
[0034]本发明还提供上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法,是 首先提取待检样品的基因组DNA,分别加入到检测反应体系和质控反应体系,进行荧光定量 PCR反应;另外设置非模板对照和阳性对照,与待检样品的基因组DNA进行同样的操作;根据 Ct值分析检测结果:
[0035]首先需要满足J0E信号Ct值< 25,非模板对照的FAM信号不起线,阳性对照的FAM信 号Ct值 < 20;9〈Ct廠< 18;然后按照ACt=Ct_-Ct廠判定,ACt< 11 · 1为阳性,ACt>l1 · 1 为阴性;
[0036]所述Ct獅j为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值,所述(???为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。 [0037]优选地,上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法中,荧光定 量PCR反应的条件为:
[0038] 95〇C10min;
[0039] 92°C15sec,58°Clmin,共 15 个循环;
[0040] 92°C15sec,60°Clmin,共 30 个循环;在 60°C时收集信号。
[0041] 与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
[0042] (1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术,可以特异性的检测人类 PDGFRA基因D842V突变。其中,特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列; 在此基础上,阻断探针与野生型序列特异性结合,有效抑制了野生型的非特异性扩增,进一 步提高体系的特异性水平,从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。
[0043] (2)在本发明实时荧光PCR外控检测
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1