检测人riok2基因表达量和相对表达量的引物对的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域中检测人RI0K2基因表达量和相对表达量的引物对。
【背景技术】
[0002]宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30~35岁，浸润癌为45~55 岁，近年来其发病有年轻化的趋势。临床上的诊断方法一般为细胞刮片检测、阴道镜检测、 组织活检等。但是，子宫肌瘤、子宫内膜异位、宫颈息肉、溃疡等原因会对诊断结果的确定性 造成严重干扰。因此，寻找新的宫颈癌诊断标志物至关重要。
[0003] RI0K2(RI0 kinase 2)基因是一种磷酸激酶。有研究表明该基因与AKT信号通路有 关，可以调控细胞迀移、细胞周期、细胞凋亡等行为。在宫颈癌当中，与癌旁组织相比，RI0K2 的表达明显升高。因此，RI0K2有希望成为潜在的宫颈癌诊断标志物。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是如何检测人RI0K2基因表达量或相对表达量。
[0005]为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或 相对表达量的引物对。
[0006] 本发明所提供的检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相对表达量的引物对，为 名称为RI0K2-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
[0007]为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人类RI0K2基因表达量或 相对表达量的成套试剂。
[0008]本发明所提供的检测或辅助检测人类RI0K2基因表达量或相对表达量的成套试 剂，由所述RI0K2-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。
[0009] 上述成套试剂中，所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单 链DNA组成。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相 对表达量的试剂或试剂盒。
[0011]本发明所提供的检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相对表达量的试剂或试剂 盒，由所述RI0K2-P或所述成套试剂与XI组成，所述XI为进行定量PCR扩增所需试剂。
[0012] 上述试剂或试剂盒中，所述进行定量PCR扩增所需试剂可为qPCRMIX^PCRMIX可 为北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司产品。
[0013]上述试剂或试剂盒中，所述定量PCR扩增可为实时荧光定量PCR扩增。
[0014]为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相 对表达量的系统。
[0015] 本发明所提供的检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相对表达量的系统，由所 述RI0K2-P、所述成套试剂或所述试剂或试剂盒与Y1组成，所述Y1为进行RNA提取所需的试 剂、进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。
[0016]上述系统中，所述进行RNA提取所需的试剂可为TRIzol、氯仿、异丙醇和/或乙醇。TRIzol可为上海捷瑞生物工程有限公司产品。
[0017] 所述进行反转录所需的试剂可为ReverTranscriptqPCRRTKit中的试剂。 ReverTranscriptqPCRRTKit为Takara公司产品。
[0018] 所述进行定量PCR扩增所需仪器可为实时荧光定量per仪（如ABI7300或ABI7500 (美国AppliedBiosystems公司））。
[0019]为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系 统。
[0020]本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统，包括所述RI0K2-P、 所述成套试剂、所述试剂或试剂盒或所述检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相对表达 量的系统与基因定量数据处理系统;所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组 织和/或细胞的RI0K2基因的表达量或相对表达量，根据所述待鉴定组织和/或细胞的RI0K2 基因的表达量或相对表达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。
[0021]为解决上述技术问题，本发明还提供了检测RI0K2基因的表达量或相对表达量的 方法。
[0022] 本发明所提供的检测RI0K2基因的表达量或相对表达量的方法，包括以离体的待 鉴定组织和/或细胞的cDNA或RNA为模板，用所述RI0K2-P进行PCR扩增，所述PCR扩增中的退 火条件可为58°C35sec。反应条件具体可为：95°C预变性lmin; 95°C15s，58°C35sec，40个循 环。
[0023] 所述PCR扩增时的反应体系可为25yL反应体系，具体如下：2yLcDNA溶液，12.5yL qPCR1^义（2\)，1?101(24(1?101(24在该反应体系中的浓度为0.2以]\〇，1?101(2-1?(1?101(2-1?在该 反应体系中的浓度为0.2μΜ)，用无菌蒸馏水补至25yL。
[0024]为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方 法。
[0025]本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法，包括:检测来自待鉴 定组织和/或细胞的RI0K2基因的表达量或相对表达量；如果所述待鉴定组织和/或细胞的 RI0K2基因的表达量或相对表达量越高，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织 和/或细胞的风险越大，如果所述待鉴定组织和/或细胞的RI0K2基因的表达量或相对表达 量越低，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。
[0026] 上述方法中，所述待鉴定组织和/或细胞可为宫颈组织和/或宫颈细胞。
[0027]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述RI0K2-P、所述成套试剂、所述试剂或 试剂盒或所述系统在下述1 )_5)中任一种中的应用：
[0028] 1)检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相对表达量；
[0029] 2)制备检测或辅助检测人RI0K2基因表达量或相对表达量产品；
[0030] 3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞；
[0031] 4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。
[0032]上述应用中，所述肿瘤组织和/或细胞可为宫颈癌组织和/或细胞。
[0033]实验证明，本发明的引物对能够检测RI0K2在宫颈癌组织中的表达含量，操作相对 简单，结果准确。
[0034]本发明鉴于现有技术中检测宫颈癌样品标志物的不足，本发明设计了检测内参/ 目的基因用引物，用荧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引 物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测RI0K2基因相对 表达量的试剂盒。
[0035]使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术对RI0K2基因的表达水平进行检测，检 测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建 RI0K2和内参基因GAPDH的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和RI0K2拷贝数， 相比于以往的免疫组化方法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将 反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的 条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助 于临床样品的辅助性检测。
【附图说明】
[0036] 图1为RI0K2熔解曲线。
[0037] 图2为GAPDH熔解曲线。
[0038] 图3为RI0K2和GATOH的扩增曲线。其中。左侧为GAH)H扩增曲线，右侧为RI0K2扩增 曲线。
[0039]图4为6位临床宫颈癌患者RI0K2的相对表达量。
【具体实施方式】
[0040]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0041]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0042]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]实施例1
[0044]本发明的用于检测RI0K2基因相对表达量的试剂盒