检测辣椒环斑病毒的rt-pcr引物对及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物病毒检测技术领域，涉及一种辣椒环斑病毒（Chilliringspot virus，ChiRSV)的检测，具体涉及一种特异性检测茄科植物叶片组织中是否感染有辣椒环 斑病毒的RT-PCR引物对及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 马铃薯Y病毒属是马铃薯Y病毒科最大的一个属，有近200种明确的或暂定的病毒 种或亚种。辣椒环斑病毒(Chilliringspotvirus，ChiRSV)是于2008年由Ha等在对越南农 作物上对马铃薯Y病毒属病毒进行调查时，在越南辣椒上首次发现的。2009年被ICTV确定为 马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的确定种，是辣椒上发现的病毒新种。ChiRSV侵染茄科植物 后出现叶片变小，花叶畸形等症状，侵染辣椒后引起的症状与辣椒脉斑驳病毒（Chi11i veinalmottlevirus，ChiVMV)引起的症状相似，引起严重的叶片畸形、扭曲，落花、果实畸 形掉落等症状。
[0003] 国内外对烟草花叶病毒属许多成员的不同株系间的分化和遗传变异做出较深入 的研究，然而辣椒环斑病毒因为是新发现的病毒却鲜见对其进行研究与分析。2011年龚殿 等首次报道了该病毒在中国的存在，并首次公布了全基因序列。据王健华等调查显示， ChiRSV在海南特色辣椒黄灯笼辣椒的检出率高达6 2 %，且该病毒可与辣椒脉斑驳病毒 (Chilliveinalmottlevirus，ChiVMV)、辣椒轻斑驳病毒（Peppermildmottlevirw， PMMoV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)等多种病毒复合侵染，加重辣椒病 情。章绍延等通过提纯病毒，免疫新西兰大白兔制备了该病毒的多克隆抗血清，为辣椒环斑 病毒的检测提供了免疫学检测方法。但其只限于实验理论阶段，并没有产生相应的试剂盒。 黄建华等人建立了检测辣椒环斑病毒的PCR引物，但其引物并非针对辣椒环斑病毒的CP基 因，而本申请人实验室目前获取的辣椒环斑病毒序列通过Blast比对，发现与目前NCBI上所 报道的辣椒环斑病毒序列匹配度仅为93%-91 %，而使用黄等人建立的PCR检测引物，扩增 出非目的条带或无法扩增出目的条带。另外根据马铃薯Y病毒属重组率高的特点，将PCR检 测引物建立在非CP基因保守区域存在较大检测错误，或误检测的可能。因此，需要找到更加 合适的辣椒环斑病毒PCR检测引物。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种检测辣椒环 斑病毒的RT-PCR引物对，其针对国内发现的辣椒环斑病毒(ChiRSV)，根据Genbank发布的 ChiRSV的CP保守序列，设计一对特异性引物，同时提供利用该引物对对茄科植株进行RT-PCR检测的方法，以判断该茄科植株是否感染辣椒环斑病毒，本方法能够直接、快速、准确地 检测出茄科植株是否感染了辣椒环斑病毒。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种检测辣椒环斑病毒的 RT-PCR引物对，该引物对序列如下：
[0006]正向引物ChiRSV-F:GCTGATACACAAGCCGTAGA(如SEQIDNo.l所示）；
[0007]反向引物ChiRSV-R:GCAAACCATACCTTGGCATA(如SEQID吣.2所示）。
[0008] 本发明同时提供一种检测辣椒环斑病毒的RT-PCR方法，该方法是以上述的引物对 对待测样品进行RT-PCR扩增，再电泳鉴定。所述扩增产物大小为571bp。
[0009]本发明检测辣椒环斑病毒的过程如下：
[0010]1)取待测样品，提取其总RNA;
[0011] 2)以步骤1)得到的RNA为模板，通过反转录，得到cDNA;
[0012] 3)以步骤2)得到的cDNA为模板，用前述引物对其进行PCR扩增；
[0013]4)对PCR产物进行凝胶电泳，然后根据扩增产物大小判断病毒感染情况，若扩增产 物大小为571bp，则待测样品感染了辣椒环斑病毒。
[0014] 上述PCR检测的反应体系：10xPCRBuffer5yl、dNTPs5yl、PCRTaq2yl、cDNA模 板2.5μ1、正向引物ChiRSV-F2μ1、反向引物ChiRSV-R2μ1、超纯水补至50μ1。反应程序:94 °C预变性2min;40个循环参数为，94°C30s，58°C退火30s72°Clmin;最后72°C10min。
[0015]上述待测样品为茄科植物。
[0016]本发明检测辣椒环斑病毒的具体过程如下：
[0017] 1.引物设计:根据Genbank发布的辣椒环斑病毒全基因组或部分序列的保守序列， 依据ChiRSV的CP保守序列，设计引物(见下表1)，检测引物扩增片段大小为571bp。
[0018] 表1PCR检测辣椒环斑病毒的引物及片段大小
[0019]
[0020] 2.PCR检测过程：
[0021 ] 1)待测植株叶片RNA的获得:取田间茄科植株幼嫩叶片，冰上保存并带回实验室， 提取总RNA;
[0022] 2)以步骤1)得到的RNA为模板，以OligodTPrimer为引物，通过反转录，得到cDNA；
[0023] 3)以步骤2)得到的cDNA为模板，用表1中的引物对其进行PCR扩增；
[0024] 反应体系（按50μ1计）：10xPCRBuffer5yl、dNTPs5yl、PCRTaq2μ1、模板（cDNA) 2.5μ1、正向引物核苷酸序列2μ1，反向引物核苷酸序列2μ1、超纯水补至所需体积。
[0025]PCR程序：94°C2min预变性后，40 个循环参数为，94°C30s，58°C退火 30s72°Clmin，最后 72°C10min。
[0026] 4)PCR产物凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据目的片段大小及阳性对照，判断病 毒感染情况。
[0027]本发明根据ChiRSV的CP保守序列设计引物，该引物特异性好且具有较高的灵敏 性;利用该此引物采用RT-PCR方法检测辣椒环斑病毒(ChiRSV)，不仅于检测时不需加辅助 引物，而且在降低检测成本、减少工作量的同时，还能快速、准确、灵敏地鉴定茄科植物是否 受该种病毒的侵染而产生了病毒类疾病，能达到指导生产的目的。
【附图说明】
[0028]图1为本发明引物对扩增的序列片段的琼脂糖凝胶电泳图。
[0029] 图中，M:DNAmarker; 1:以水为模板的对照，2:健康的辣椒叶片，3:感染ChiRSV的 辣椒叶片。
[0030] 图2为不同退火温度下，本发明引物对扩增序列片段的琼脂糖凝胶电泳图。
[0031] 图中，M:DNAmarker;泳道 1-6的温度分别为60、58、56、54、52和50°(3。
[0032]图3为模板的不同稀释倍数下，本发明引物对模板稀释倍数灵敏度的琼脂糖凝胶 电泳图。
[0033] 图中，M:DNAmarker;泳道1-6的cDNA浓度依次为模板初始浓度的10Q、10-^ΙΟ-2、 10-3、1