用于表达肽和蛋白的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物学、重组肽和蛋白表达领域，且涉及包含含有Tl SS底物/转运 物或其片段的核苷酸序列用于高效生产目的重组肽和蛋白的方法。所述转运物或其片段促 进目的重组肽和蛋白作为包涵体(IB)的表达，可充当IB标记。
【背景技术】
[0002] 近年来，重组蛋白/酶的生产在工业生产过程中的用途已变得越来越重要，且可以 预期许多工业过程即将涉及重组技术。目前，生物活性肽和蛋白用作各种疾病中的治疗剂， 例如，糖尿病(胰岛素），病毒感染和白血病(干扰素），免疫系统疾病（白介素），和红血细胞 不足(红细胞生成素）。此外，各种工业应用中需求大量蛋白和肽，包括，例如，纸浆和造纸工 业，纺织业，食品行业，个人护理和化妆品工业，糖精制，废水处理，酒精饮料生产和用于生 产新药物的催化剂。
[0003] 然而，重组肽和蛋白的表达仍然受限，要获得大量、高纯度且天然折叠的期望的肽 和蛋白需要付出巨大努力。
[0004]通常，由于特性类似的蛋白难以区分，产品的纯化是昂贵的，特别是达到100%纯 度的最后一步，容易成倍增加费用（Hacking, A.J.( 1986)Economic aspects of biotechnology,Cambridge University Press)。
[0005] 在许多情况下，表达不溶形式的蛋白或肽是有用的，尤其是当目的肽(PeOI)或蛋 白（PrOI)相当短、通常为水溶性和/或在宿主细胞内面临蛋白降解时。生产不溶形式的肽， 既便于简单回收，又保护肽不遭受蛋白降解。一种用于生产不溶形式的肽的方法，是通过在 所述融合肽中包括至少一种诱导IB形成的溶解性标记（即，包涵体（IB)标记），从而重组产 生作为不溶融合肽/蛋白的一部分的肽。典型地，融合蛋白设计为包括至少一个可裂解的肽 接头，从而使得PeOI或PrOI可随后从融合蛋白中回收。该融合蛋白可被设计为包括多个IB-标记，可裂解肽接头和编码PeOI或PrOI的区域。
[0006] 促进不溶性蛋白表达且包含肽标记的融合蛋白是公知的现有技术。通常，所述嵌 合或融合蛋白的标记部分大，增加该融合蛋白的不可溶可能性。通常使用的大肽的例子包 括但不限于：氯霉素乙酰转移酶acetyltransferase(Dykes et al.，（1988) Eur .J.Biochem.，174:411)，β半乳糖苷酶（ScheIlenberger et al ·，（ 1993)Int .J.Peptide Protein Res.，41:326;Shen et al.，（1984)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 281:4627;和Kempe 6七31.，（1985)661^，39:239)，谷胱甘肽5-转移酶（1^7 6七31.，（1993)8丨。/^6(^11。1〇87， ll:64and Hancock et al.(W094/04688))，L-核酮糖激酶的N端（美国专利5206154和Lai et al ·，（1993)Antimicrob.Agents&Chemo. ,37:1614)， 菌体T4gp55蛋白protein(Gramm et al ·，（ 1994) Bio/Techno logy ,12:1017)，细菌酮类固醇异构酶蛋白（Kul iopulos et al.，（1994)J Am.Chem.Soc.ll6:4599和美国专利5648244)，泛素 （Pilon et al. ,(1997) Biotechnol .Prog.，13:374-79)，牛凝乳酉每原（Haught et al ·，（1998) Biotechnol · Bioengineer · 57: 55-61 )，和杀菌/渗透性增强蛋白（〃BPI〃 ； Better，M. D · and Gavit，P D.，美国专利6242219)。本领域中存在大量该技术的具体例子，例如参见美国专利 6037145,其中教导了一种保护已表达嵌合蛋白不受特定蛋白酶影响的标记；美国专利 5648244,其中教导了具有便于期望蛋白纯化的标记和裂解接头的融合蛋白的合成;和美国 专利5215896、5302526; 5330902;和美国专利申请公开No. 2005/221444,其中描述了包含专 门设计用于增加嵌合蛋白或肽不溶性的氨基酸组合物的融合标记。
[0007] 然而，本领域中已知的方法没有提供任何解决PeOI或PrOI复性的方法。因此，本领 域中仍需要能够改进重组PeO I和PrO I生产的方法。
[0008] 本发明人发现，包括含溶血素 A(HlyA)或脂酶A(LipA)基因片段的核酸序列的方 法，能够解决现有技术中的上述需要。两种基因均是I型分泌系统(TlSS)，其主要存在于革 兰氏阴性菌，且通过单一步骤将其同源底物从胞浆运输至细胞外介质，而无需形成周质底 物中间体。TISS家族中，Bakkes et a 1.所述的涉及HlyA作为运输底物的HlyTISS特别令人 感兴趣，因为它携带具有共有序列GGxGxDxUxU:任意氨基酸残基，U:大的疏水性氨基酸残 基）的所谓66重复序列（〇3切1&23，!1.6七31.，（1995迮1^了8丨〇(*6111228,39-44)。所述66重 复序列对Ca 2+高亲和力结合，所述结合发生于TlSS转运物分泌到Ca2+浓度高（多至mM范围） 于细胞内部的细胞外部之后。结合到GG重复序列的Ca 2+催化转运物折叠成天然活性构象， 且Ca 2+离子充当了折叠辅助细胞/分子伴侣（Jumpertz,T.et al. ,Microbiology 156， 2495-2505，doi:mic.0.038562-0[pii])。大肠杆菌的HlyA TlSS的其他成分包括内膜蛋白 HlyB，其为ATP结合盒(ABC)转运子，外膜蛋白（OMP)TolC和内膜的膜融合蛋白（MFP)HlyD。
【发明内容】
[0009] 本发明的第一方面中，涉及用于生产期望的重组PeOI或PrOI的方法，其中所述方 法包括：（a)将编码包含至少一个PeOI或PrOI和至少一个I型分泌系统(TlSS)的转运物或其 片段的融合蛋白的核酸分子，引入宿主细胞中，其中所述宿主细胞不表达所述TlSS的异源 ABC转运子，异源MFP和/或异源OMP; (b)在允许所述融合蛋白表达的条件下培养所述宿主细 胞，其中所述融合蛋白的表达形式为IB; (c)从所述宿主细胞分离所述重组融合蛋白；和(d) 令所述重组融合蛋白暴露在允许所述PeOI或PrOI折叠为功能性三维构象的条件下。
[0010] 在多个实施例中，所述TISS转运物选自：HlyA，CyaA，EhxA，LktA，PILktA，PasA， PvxA,MmxA,LtxA,ApxIA,ApxIIA,ApxIIIA,ApxIVA,Apxl,ApxII,AqxA,VcRtxA,VvRtxA, MbxA，RTX细胞毒素，RtxLl，RtxL2，FrhA，LipA，Tl iA，PrtA，PrtSM，PrtG，PrtB，PrtC，Apr A， AprX，ZapA，ZapE，Sap ,HasA，大肠杆菌素 V ,LapA，ORF ,RzcA ,RtxA ,XF2407，XF2759 ,RzcA， RsaA，Crs，CsxA，CsxB，SlaA，SwmA，SI11951，NodO，PlyA，PlyB，FrpA，FrpC。
[0011] 在优选实施例中，所述TlSS转运物是包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列、其片段或 与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或其片段具有至少80%序列一致性的多肽的HlyA，或由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列、其片段或与SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或其片段具有至少80% 序列一致性的多肽组成的HlyA。
[0012] 在更优选的实施例中，所述HlyA片段由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列或与SEQ ID N0:4所示氨基酸序列具有至少80%序列一致性的多肽组成。
[0013] 在多个实施例中，所述表达培养基包含20.0 mM或以下的Ca2+。
[0014]在另一些实施例中，本发明涉及一种方法，其中所述宿主细胞中，所述TlSS的内源 ABC转运子基因、内源MFP基因和/或内源OMP基因的表达，或其相应基因产物的活性，受到抑 制或转运低效。
[0015]在其他各种实施例中，所述宿主细胞不表达所述TlSS的内源ABC转运子，内源MFP 和/或内源OMP。
[0016] 在另一些实施例中，所述重组多肽或蛋白可以暴露在复性缓冲液中，其中所述复 性缓冲液包含至少〇. OlmM的Ca2+。
[0017] 在本发明的方法的各种实施例中，（I)所述宿主细胞为原核细胞;和/或（II)所述 表达在基本培养基中发生;和/或（III)所述重组融合多肽或蛋白通过亲和层析、离子交换 层析、反相层析、体积排阻色谱及其组合;和/或（IV)所述方法包括又一步骤(e)，其中令所 述重组融合蛋白接触适用于裂解所述融合蛋白以生成作为分离分子的所述转运物和所述 肽或PrOI的蛋白酶;和/或(V)所述方法包括又一步骤(e)，其中通过化学处理裂解所述重组 融合蛋白，以生成作为分离分子的所述转运物和所述PeOI或PrOI;和/或(VI)所述方法包括 如（IV)或(V)所限定的步骤(e)，其后还进行对所述PeOI或PrOI的纯化。
[0018] 在另一些实施例中，本发明还可以涉及一种方法，其中所述至少一个PeOI或PrOI 选自乳链菌肽，HCRF，IFABP，IFNA2，MBP，肽 101，肽 102，肽 103，MAB-40，Mab-42，Fuzeon?，鲑 降钙素，人降钙素，肽1、238、239、240或241。
[0019] 此外，在另一些实施例中，所述编码所述融合蛋白的核酸分子还包括调控所述融 合蛋白表达的调控核苷酸序列。
[0020] 应当理解，上述实施例的所有组合也应视为包含在本发明的范围中。
【附图说明】
[0021 ]图1所示为部分所用质粒结构的示意图。
[0022]图2所示为融合至HlyAl/HlyAc的N端的IFABP和MBP(及其突变体）的细胞裂解物的 不溶性部分和可溶性部分的SDS-PAGE凝胶分析（15 % )(图2A)。将样品上样到SDS-PAGE并用 考马斯亮蓝(CBB)染色。图2B所示为表达HlyAl和所示PrOI或PeOI的融合蛋白的大肠杆菌的 细胞裂解物样本，其中PrOI或PeOI融合至HlyAl的C端，通过SDS-PAGE分析，并用CBB染色显 现。图2C所示为产生IFABP wt(由质粒的pQE-IFABP wt编码）或HlyAl-IFABP wt(由pIAR_ 207编码）的细胞经细胞破碎后得到的可溶性和不溶性部分的SDS-PAGE (15)分析，其中指示 了HlyAl-IFABP wt的可溶性降解产物。图2D所示为融合至HlyAl的肽238，239，240和241的 表达，表明若无融合蛋白HlyAl则肽240和241无法表达。
[0023] 图3所示为HlyAl在EDTA或Ca2+的存在下复性并用于IMAC和SEC分析的实验。A:在 Ca2+的存在下，携带N端His6标记的HlyAl被载入頂AC(左泳道），所结合的蛋白用咪唑梯度液 洗脱。B:从頂AC洗脱的HlyAl的SEC分析（Superdex 7510/300柱，GE Healthcare) X&D:在 EDTA的存在下对HlyAl进行IMAC和SEC分析。
[0024]图4所示为HlyAl-乳链菌肽(Nisin)在EDTA或Ca2+的存在下复性、浓缩并用于SEC分 析的实验。A = HlyAl-乳链菌肽在Ca2+的存在下复性后的不溶部分（"滤渣"）和可溶部分（"上 清液"）以及SEC分析的洗脱部分。B = HlyAl-乳链菌肽在EDTA的存在下复性后的不溶部分 ("滤渣"）和可溶部分（"上清液"）以及SEC分析的洗脱部分。C:A和B的SEC色谱。D = HlyAl-Nisin与Xa因子(NEB)共培养，在不同时间点（从左至右为0,20,40,60,90，120分钟）从混合 物中取样，加载于SDS-PAGE凝胶并用CBB染色。E:对照乳链菌肽(上线）和以本发明技术制备 的乳链菌肽(下线）的HPLC色谱图。F: HPLC洗脱部分的SDS-PAGE分析。左侧泳道:90分钟后的 Xa因子反应，其他泳道:HPLC洗脱部分。箭头指示的是乳链菌肽和HlyAl的位置。
[0025]图5所示为LipAl-乳链菌肽在EDTA或Ca2+的存在下复性的实验。LipAl-乳链菌肽在 大肠杆菌中制备为IBs形式，且分离的IBs分别在EDTA或Ca2+的存在下复性。在Ca2+的存在 下，制得的纯净可溶的LipAl-乳链菌肽为均质状态。与此相反，在EDTA的存在下，LipAl-乳 链菌肽产生聚集。A和B: SEC洗脱部分的SDS-PAGE分析和在Ca2+的存在下复性的LipAl-乳链 菌肽的相应SEC色谱。C和D:在EDTA的存在下复性并如A和B中所述进行分析的LipAl-乳链菌 肽。
[0026] 图 6 所示为由 pIAR_215，pIAR_220，pIAR_221，pIAR_222 和 pIAR_223 编码的肽的表 达分析，以及表达出的肽（由pIAR_220，pIAR_222和pIAR_223编码)在EDTA和Ca2+的存在下的 复性实验。所示蛋白在大肠杆菌中制备为IBs形式，且分离的IBs分别在EDTA或Ca 2+的存在下 复性。A:所示样品的SDS-PAGE分析。B-G:复性后的所述蛋白的SEC分析。
[0027] 图7所示为HCRF的制备。A:由质粒pIAR_202编码的HlyAl-HCRF的IBs，在EDTA或Ca 2+ 的存在下复性。B = HlyAl-HCRF在Ca2+的存在下复性，与Xa因子共培养10分钟，40分钟和120分 钟。箭头分别表示HlyAl-HCRF，HlyAl和HCRF的位置。在含有EDTA或Ca 2+的缓冲液中复性的 HlyAl-HCRF，进行SEC分析，且洗脱部分进行SDS-PAGE分析。C:上述SEC分析的洗脱液色谱 图。D:在Ca 2+的存在下复性的HlyAl-HCRF在SEC分析后的CBB染色SDS-PAGE凝胶分析。E:在 EDTA的存在下复性的HlyAl-HCRF在SEC分析后的CBB染色SDS-PAGE凝胶分析。箭头指示 Hl yA I-HCRF的位置。Hl yA I-HCRF在Ca2+的存在下复性，与Xa因子培养2小时，消化混合物通过 HPLC纯化。F: HPLC色谱。G: HPLC洗脱部分的CBB染色SDS-PAGE凝胶分析。箭头指示HCRF的位 置。
[0028] 图8所示为HlyAl-IF ABP的制备的功能研究。复性HlyAl-IF ABP的SEC分析。A和C: 在Ca2+的存在下复性的HlyAl-IF ABP的SEC分析洗脱部分的SDS-PAGE凝胶分析和和洗脱部 分SEC色谱图。B和D:在EDTA的存在下复性的HlyAl-IF ABP的SEC分析洗脱部分的SDS-PAGE 凝胶分析和洗脱部分的SEC色谱图。E:在EDTA或Ca2+的存在下纯化的HlyAl-IF ABP与Xa因子 培养，且蛋白样本在指定的时间点进行SDS-PAGE分析。箭头指示IF ABP的位置。F和G:采用 DAUDA滴定实验对HlyAl-IFABP进行功能研究。F = HlyAl-IFABP在Ca2+的存在下复性并通