产生中和金黄色葡萄球菌lukgh(lukab)毒素的高效抗体的制作方法
【专利说明】产生中和金黄色葡萄球菌LUKGH(LUKAB)毒素的高效抗体
【背景技术】
[0001 ]金黄色葡萄球菌(S. aureus)是最重要的人类病原体之一，引发人类从无症状定植 和中度皮肤感染到严重的深度组织感染、肺炎、血液感染和败血症等范围广泛的各种感染。 这种病原体利用几种致病机制引发疾病和干扰宿主防御。它最有效的毒力因子之一是专门 杀死白细胞，特别是吞噬细胞的杀白细胞素。LukGH(亦称为LukAB)是最近被鉴定出来的杀 白细胞素，能够溶解多形核细胞（PMN)、单核细胞和树突状细胞（Dumont et al，2011; Ventura et al ,2010)，还可以激活它们，产生促炎细胞因子。US20110274693A1描述了Luk A或LukB抗体，特别是抗-LukA多克隆抗体。
[0002] LukGH 是一种类似于 HlgAB、HlgCB、LukED 和 LukSF(PVL)的双组分溶细胞素。LukH (S-组分)和LukG(F-组分）与上面提到的双组分杀白细胞素的S组分和F组分分别具有大约 30 %和40 %的氨基酸同源性。
[0003] Malachova等人（The Journal of Infectious Diseases，Epub 2012 Aug.7， vo1.206，no. 8，pp 1185-1193)描述了LukGH的纯化，采用SDS-PAGE分析时，LukGH具有两条 独立的条带。
[0004] LukGH是最多变的双组分金黄色葡萄球菌毒素。虽然LukSF、LukED和HlgABC在不同 的金黄色葡萄球菌菌株中高度保守，但是，LukGH显示高达14%的氨基酸变化。这种氨基酸 差异水平几乎接近在两种不同毒素如HlgC vs LukS或LukS vs HlgAC或LukE之间观察到的 水平（~16%差异性）。关于LukGH的作用的数据很少，而且数据都是采用彼此几乎相同的 Newman菌株和LAC菌株(USA300)的两个序列得到的。人们不知道其它变体对人细胞是否有 活性，特别是来自两种金黄色葡萄球菌基因组的两个序列--MRSA252(EMRSA16)和 MSHRl 132( "银"金黄色葡萄球菌），它们被认为与USA300和其它金黄色葡萄球菌克隆复合物 最不相同。
[0005] 根据金黄色葡萄球菌培养上清液的PMN裂解活性，LukGH似乎是人类天生细胞最有 效的白细胞毒素之一（Dumont et al，2013,Maiachowa et al,2012)。因此，有理由认为，在 金黄色葡萄球菌引发的疾病期间，通过中和抗体抑制LukGH的毒素作用具有积极的效果，并 且通过减少迀移到感染部位的吞噬细胞，支持宿主防御。我们的目的是利用中和LukGH毒素 的单克隆抗体，开发出预防和治疗人类金黄色葡萄球菌感染的人类治疗方法。
[0006] 根据文献，双组分杀白细胞素中的S组分识别细胞表面受体，这种相互作用诱导构 象变化，导致F组分结合和形成LukSF和HlgAB的八聚体跨膜孔隙结构（Col in ,Infect Immun,1994:3184；Meunier,Biochim Biophys Acta,1997:275)〇
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种抗金黄色葡萄球菌细胞毒素 LukGH(亦称为LukAB)的抗 体，这种抗体与这种毒素 LukGH的不同变体具有交叉反应性，并提供交叉中和效力。
[0008] 本发明的目的通过本发明的主题达到。
[0009] 本发明提供一种包含LukGH复合物的分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素抗原。
[0010] 特别是，该LukGH复合物包括LukG和LukH组分的二聚体或低聚体。特别是，LukGH复 合物是异源二聚体或低聚体LukGH抗原。这种抗原特别是以水相中可溶的异源二聚体或低 聚体的形式提供，特别是不与在LukGH结合时容易发生细胞溶解的细胞(如PMN、单核细胞或 树突状细胞)的表面结合。
[0011]特别是，LukGH复合物由源自金黄色葡萄球菌菌株的重组蛋白与/或蛋白组成。
[0012] 特别是，LukG和LukH组分由天然来源与/或共-重折叠纯化的重组宿主细胞共表 达。
[0013] 特别是，抗原是以可溶形式的蛋白复合物提供。
[0014] 特别是，抗原能够与人⑶Ilb/⑶18受体结合。
[0015] 本发明进一步提供一种与LukGH复合物特异性结合的抗体。特别是可以证明，与单 独(单体）的LukG或LukH的结合相比，本发明抗体与异源二聚体或低聚体LukGH抗原的结合 明显改善很多。
[0016 ]特另Ij是，所述抗体能够中和LukGH复合物。
[0017] 特别是，抗体与源自USA300克隆，优选源自TCH1516菌株的LukGH复合物，及至少一 个LukGH复合物变体结合。
[0018] 特别是，与源自USA300克隆的LukGH复合物相比，LukGH复合物变体在LukG或LukH 任一组分的氨基酸序列中有至少一个点突变，例如，序列中一个或多个氨基酸残基的改变。 甚至源自MRSA252和MSHR1132菌株的完全不同的LukGH复合物变体也可以与本发明的抗体 交叉特异性结合和交叉中和。
[0019] 特别是，源自USA300克隆的LukGH复合物包括含SEQ ID 4氨基酸序列的LukG组分 与/或含SEQ ID 2氨基酸序列的LukH组分。
[0020] 特别是，LukGH复合物变体包括含选自 SEQ ID 8、12、13、14、15、16、17、18、19和20 的氨基酸序列的LukG组分与/或含选自SEQ ID 6、10、21、22、23、24、25、26、27和28的氨基酸 序列的LukH组分。
[0021 ]特别是，抗体交叉中和LukGH复合物和LukGH复合物变体。
[0022] 本发明进一步提供测定金黄色葡萄球菌LukGH双组分溶细胞素结合或毒性的方法 中使用的人⑶Ilb/⑶18复合物。
[0023] 特别是，⑶Ilb/⑶18复合物以其天然形式、或分离形式或固定形式使用。
[0024] 本发明特别提供一种交叉中和抗体，其包括至少一个与源自USA300克隆（如菌株 TCH_1516)的LukGH及至少一个LukGH变体结合的多特异性结合位点。特别是，LukGH毒素选 自EMRSA16 MRSA252菌株或MSHRl 132菌株表达的基因。
[0025] 出乎意料的是，我们发现，应用能够产生金黄色葡萄球菌其它双组分白细胞毒素 的中和抗体的同一方法对LukGH毒素无效。本发明对这种毒素的不同作用模式进行描述，特 别提供毒素复合物，而不是单一无毒组分用于选择和产生抗体。
[0026] 特别是，本发明的抗体是全长单克隆抗体或其片段，所述片段包含至少一个含结 合位点的抗体域，优选抗体选自鼠源、嵌合、人源化或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单 域抗体(如VH、VHH或VL )，优选人I gG 1抗体。
[0027]抗体优选结合LukGH复合物的亲和力的Kd小于I (T8M，优选小于I (T9M。
[0028]根据本发明的一个具体方面，在基于细胞的试验中，抗体显示出体外中和效力， IC50低于50: ImAb:毒素比率(mol/mol)，优选低于10:1，更优选低于1: 1。
[0029] 根据本发明另一个具体方面，抗体中和动物（包括人和非人的动物）中的靶向毒 素，并抑制体内金黄色葡萄球菌的发病机理，优选任何肺炎、菌血症或败血症、腹膜炎和骨 髓炎模型。
[0030] 根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，其中在一定条 件下培养或维持本发明的重组宿主细胞，以产生所述抗体。
[0031] 根据本发明另一个方面，本发明提供一种鉴定候选保护抗体的方法，包括：
[0032] (a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样本;及
[0033] (b)评价样本中的抗体或样本产生的抗体与本发明LukGH复合物的结合，其中抗体 和LukGH复合物之间呈阳性反应鉴定出抗体是候选保护抗体。
[0034] 根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
[0035] (a)提供按照本发明鉴定方法鉴定的候选保护抗体;及
[0036] (b)产生单克隆抗体，或人源化或人形式的候选保护抗体，或其与候选保护抗体具 有相同表位结合特异性的衍生物。
[0037] 根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
[0038] (a)采用本发明的LukGH复合物给非人动物免疫接种；
[0039] (b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
[0040] (c)筛选b)中获得的细胞系，以鉴定产生与LukGH复合物结合的单克隆抗体的细胞 系;及
[0041] (d)产生所述单克隆抗体，或人源化或人形式的抗体，或其与所述单克隆抗体具有 相同表位结合特异性的衍生物。
[0042] 根据本发明另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
[0043] (a)采用本发明的LukGH复合物给非人动物免疫接种；
[0044] (b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
[0045] (c)筛选细胞系，以鉴定产生与LukGH复合物和至少一种LukGH复合物变体结合的 单克隆抗体的细胞系；
[0046] (d)产生所述单克隆抗体，或人源化或人形式的抗体，或其与所述单克隆抗体具有 相同表位结合特异性的衍生物。
[0047] 根据另一个方面，本发明提供本发明抗体的医学用途，包括人类医学用途和兽类 医学用途。特别是，抗体用于处理存在金黄色葡萄球菌感染风险或者患有金黄色葡萄球菌 感染的主体，包括给主体施用有效量的抗体，以限制主体的感染，改善所述感染引起的病症 或抑制金黄色葡萄球菌肺炎发病(pathogenesis)。
[0048] 特别是，抗体用于防止金黄色葡萄球菌感染。
[0049]根据本发明的具体方面，进一步提供一种处理方法，其中存在金黄色葡萄球菌感 染风险或患有金黄色葡萄球菌感染的主体被处理，该方法包括给主体施用有效量的抗体， 以限制主体的感染，改善所述感染引起的病症或抑制金黄色葡萄球菌肺炎发病。
[0050]特别是，所述处理方法用于防止病原性金黄色葡萄球菌。
[0051 ]根据一个具体实施例，抗体以肠胃外或粘膜制剂施用。
[0052]根据本发明另一个方面，本发明提供本发明抗体的药物制剂，优选包括肠胃外或 粘膜制剂，任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0053] 根据另一个方面，本发明提供本发明的抗体，用于检测任何金黄色葡萄球菌感染 的诊断用途，所述感染包括高毒素产生的MRSA感染，如坏死性肺炎，和疖病和痈病中毒素的 产生。
[0054] 特别是，抗体提供用于本发明的用途，其中通过用所述抗体接触所述主体的体液 样本，离体测定主体的全身性金黄色葡萄球菌感染，其中出现抗体的特异性免疫反应则确 定存在感染。
[0055] 根据本发明的一个具体方面，进一步提供一种诊断主体金黄色葡萄球菌感染的方 法，包括高毒素产生的MRSA感染，如坏死性肺炎，和疖病和痈病中毒素的产生。
[0056] 特别是，提供这种诊断方法，其中通过用所述抗体接触所述主体的体液样本，离体 测定主体的全身性金黄色葡萄球菌感染，其中出现抗体的特异性免疫反应则确定存在感 染。
[0057] 根据本发明另一个方面，本发明提供本发明抗体的诊断制剂，任选包含带有标签 的抗体与/或带有标签的其它诊断试剂。
[0058] 根据本发明另一个方面，本发明提供一种免疫原，其包括：
[0059] (a)本发明的LukGH复合物；
[0060] (b)任选与(a)中所述LukGH复合物非天然相关的其它表位或抗原;及
[0061] (C)载体。
[0062] 特别是，载体是药学上可接受的载体，优选包含缓冲物质与/或佐剂物质。
[0063] 本发明的免疫原优选以疫苗制剂提供，优选用于肠胃外用途。
[0064] 特别是，本发明的免疫原提供用于医学用途，特别是通过施用有效量的所述免疫 原处理主体，以防止主体受金黄色葡萄球菌感染，或预防所述感染引发的病症，或抑制金黄 色葡萄球菌肺炎发病。
[0065] 特别是，本发明的免疫原提供用于引发保护性免疫应答。
[0066] 根据本发明的一个具体方面，进一步提供一种处理方法，其中主体存在金黄色葡 萄球菌感染风险，所述方法包括给主体施用有效量的免疫原，以预防主体感染，尤其是防止 病原性金黄色葡萄球菌感染。
[0067] 根据本发明的另一个方面，本发明提供一种编码本发明抗体的分离核酸，或编码 本发明抗原的分离核酸，特别是编码LukGH复合物或融合蛋白的分离核酸。
【附图说明】
[0068] 图 I :A:如实例 3 所描述，采用源自USA300_TCH1516、MRSA252(CC30、ST36)和 MSHR1132(CC75、ST1850)菌株的差异最大的三类LukG和LukH序列，通过人吞噬细胞确定 LukGH的毒性。B:来自不同金黄色葡萄球菌株基因组的LukG和LukH序列的关联性;C: LukG和 LukH序列变体的氨基酸序列比对(序列参见图12):
[0069] LukG:ST36_MRSA252-SEQ ID 8；
[0070] ST30_E1410-SEQ ID 13；
[0071] CC133_ED133-SEQ ID4；
[0072] ST59_M013-SEQ ID20；
[0073] ST1_MW2-SEQ ID 15；
[0074] ST8_C0L-SEQ ID 16；
[0075] ST5_USA300_TCH1516-SEQ ID 4；
[0076] ST239_JKD6159-SEQ ID 18；
[0077] ST398_0385-SEQ ID 14；
[0078] CC10/ST10_H19-SEQ ID 19；
[0079] ST1850_MSHR1132-SEQ ID 12.
[0080] LukH:ST5_Mu50-〇-SEQ ID 23；
[0081] ST5_N315-SEQ ID 24；
[0082] ST8_USA300TCH1516-SEQ ID 2；
[0083] ST239_JKD6159-SEQ ID 28；
[0084] ST80_11819-97-SEQ ID 25；
[0085] ST22_EMRSA-15-SEQ ID 27；
[0086] ST59_M013-SEQ ID 26；
[0087] ST1850_MSHR1132-SEQ ID 10；
[0088] ST10_H19-SEQ ID 21；
[0089] ST398_ST398-SEQ ID 22；
[0090] ST36_MRSA252-SEQ ID 6〇
[0091] 图2:如实例3所描述，LukG或LukH产生的抗体缺少LukGH毒素中和。
[0092] 如实例3所描述，如果mAb首先与单组分结合，用LukG或LukH产生的抗体检测 LukGH毒素中和。
[0093] 如实例4所描述，不接触靶细胞，LukH和LukG形成复合物。
[0094]图5:如实例4所描述，LukH和LukG以二聚体的形式存在于溶液中。
[0095] 如实例5所描述，利用分化的HL-60细胞，采用LukGH复合物选择而发现的高效 LukGH中和抗体。A:采用重组LukGH_TCH1516复合物进行测试；B:采用金黄色葡萄球菌 USA300_TCH1516分泌的和细菌培养上清液中存在的天然LukGH进行测试。
[0096] M:如实例5所描述，利用刚分离的人PMN，采用LukGH复合物选择而发现的高效 LukGH中和抗体。A:采用重组LukGH_TCH1516复合物进行测试;B:采用重组LukGH_MRSA