反义寡核苷酸组合物的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)组合物，并特别涉 及用于反义寡核苷酸(ASO)胞质递送(cytosolic delivery)的组合物和方法。提供部分单 链和部分双链的杂合ASO，杂交形成可非共价地键合至核酸结合蛋白区域(nucleic-acid-binding protein regions) 的双链区。这样，可产生促进反义 DNA 向革 巴 细胞中递送的 ASO:: 蛋白复合体。此类复合体可用于下调细胞中的基因表达。
【背景技术】
[0002]反义寡核苷酸已经被FDA批准用作治疗巨细胞病毒（cytomegalovirus)介导的视 网膜炎和慢性溃疡性结肠炎的抗病毒药(此61^，1998;￥&(^^^11等人，1998)(^50包括设计 为与源自特定基因的信使RNA(mRNA)转录本杂交的单链DNA片段或其类似物。如此形成的 mRNA: :AS0杂交体可被RNAse H降解。在受病毒感染的生物体中，病毒的遗传物质进入特定 细胞以复制，该复制过程需要病毒特异性mRNA的翻译。通过用对病毒mRNA特异的反义寡核 苷酸处理受感染的细胞，可防止靶病毒基因表达并阻断病毒生命周期。
[0003] 反义寡核苷酸治疗有效性的重要因素是寡核苷酸的生物利用度(Biroccio等人， 2003)。生物利用度可受到反义寡核苷酸不能穿透细胞的质膜或内膜系统的限制。由于反义 寡核苷酸的靶标(如，mRNA)位于细胞的细胞溶胶(cytosol)内，因此寡核苷酸需要在它们接 近细胞溶胶之前能够跨过细胞膜。
[0004] 解决这类反义寡核苷酸的胞质接近(cytosolic access)问题的一种方式是将所 述治疗局部施用而不是全身施用，特别是将反义寡核苷酸施用至独立的药代动力学房室， 升高反义寡核苷酸的局部浓度。例如，巨细胞病毒-介导的视网膜炎的反义寡核苷酸治疗涉 及通过玻璃体内注射将福米韦生(fomivirsen) (Vitmveneli)施用至独立的药代动力学房 室。然而，胞质接近，即，反义寡核苷酸向其祀mRNA的接近，即使在玻璃体内施用之后仍存在 大量限制（Lysik和Wu-Pong ,2003) 〇
[0005] 反义寡核苷酸细胞内递送的其它方法可涉及:对细胞膜的机械和电的细胞损伤、 高分子和脂质运载体(carriers^已知非特异性地使膜不稳定）、或病毒载体。然而，这些及 类似的方法还未被证明是临床安全或可靠的，并且(迄今为止)市场上还未产生任何批准用 于反义产品的递送技术。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在借助下述新颖排列而提供用于下调细胞内的一种或多种基因的体系 中所使用的组合物和方法，所述新颖结构为，活性反义序列(例如单链DNA的活性反义序列） 作为部分重叠的第二寡核苷酸链的侧翼，所述部分重叠的第二寡核苷酸链形成可结合至蛋 白质的核酸结合结构域的结合位点。我们将这些部分单链和部分双链的核苷酸命名为"AS0 杂交体"。出乎意料地，我们已发现并已经验地示出（未公布的数据）：
[0007] 1)AS0杂交体在无细胞试验中例如以30pMol的ASO浓度可显示与对照的单链反义 寡核苷酸相当的反义活性谱。
[0008] 2)AS0杂交体结合至核酸结合结构域(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)GAL4)来形成 复合体，而不需要先前所使用的聚阳离子亲和处理(polycationic affinity handle)(例 如聚(L-赖氨酸）(Gaur等人，2002;W097/23236))或其它共价化学缀合法。
[0009] 3)如果在ASO杂交复合体(例如GAL4: :AS0)中，核酸结合结构域融合至减毒的致死 因子结构域1(来自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)，即，LFn)，该超分子组装体可穿过源自 细菌毒力因子(virulence factor)(炭疽杆菌PA63)的孔。这是出乎意料的，因为已报道了 经PA孔的通过要求货物（cargo)的结构去组装（恪球态转变（molten globular transition)) (Zornetta等人，2010)。对于超分子复合体经PA孔转变成胞质溶胶，一定不能 发生货物的熔球态转变，即，由有序结构向无规卷曲的转变。再者，在不使用聚阳离子亲和 处理(例如聚(L-赖氨酸)下已示出该转变(Gaur等人，2002:W097/23236))。
[0010] 本发明的具体目的是提供能够使反义寡核苷酸的组合物跨过细胞膜的缀合策略。 这样，反义寡核苷酸可递送至细胞的胞质溶胶，经所记载的反义-至-蛋白缀合策略提供对 胞质溶胶内的RNA或DNA靶标(例如病毒mRNA转录本)的直接接近。
[0011] -方面，本发明提供包括一对反义寡核苷酸的反义寡核苷酸组合物，其中两条反 义寡核苷酸杂交以给出至少一单链反义序列和至少一双链蛋白结合序列。优选地，所述组 合物进一步包括穿梭蛋白（如，重组体LFn-GAL4)，其中穿梭蛋白包括识别双链蛋白结合序 列的核酸结合结构域(例如GAL4)，和其中穿梭蛋白非共价地键合至这对反义寡核苷酸。
[0012] 另一方面，本发明提供用于递送反义寡核苷酸跨过细胞的膜的体系，该体系包括 (i)一对反义寡核苷酸，这对包括双链蛋白结合序列（如，GAL4)和至少一单链反义序列（例 如，如图1所示），和（ii)穿梭蛋白，其具有能识别包含在双链蛋白结合核酸序列内的特定序 列（如，CGG-N 11-CCG)的核酸结合结构域，以便该穿梭蛋白非共价地结合至这对反义寡核苷 酸。
[0013] 在另一方面，本发明提供将反义寡核苷酸非共价地缀合至穿梭蛋白（如，LFn-GAL4)的方法，所述方法包括：（i)提供两条反义寡核苷酸，（i i)将两条反义寡核苷酸杂交以 形成反义杂交体，其中所述反义杂交体包括至少一单链反义序列和至少一双链蛋白结合序 列，（iii)提供含有识别双链蛋白结合靶序列的核酸结合结构域的穿梭蛋白，和(iv)借助蛋 白的核酸结合结构域和反义杂交体的蛋白结合序列将穿梭蛋白非共价地缀合至反义杂交 体。
[0014] 缀合和膜移位(membrane translocation)的方法不需要使用（聚阳离子或离子） DNA凝聚剂(DNA condensing agents)(例如聚（乙稀亚胺)或聚(L-赖氨酸）），因为这些物质 通常有毒，且这种毒性被认为至少部分是由于它们使细胞膜不稳定的倾向（Richardson等 人，1999)(并参见下表1)。在本发明的背景下，穿梭蛋白定义为能够传送遗传物质通过细胞 膜的孔的蛋白质。该孔可包括成孔蛋白（pore-forming protein)，例如炭疽杆菌PA83或 PA63〇
[0015]本发明的寡核苷酸包括核酸序列，该核酸序列可为DNA或DNA类似物(例如某些氧 原子被硫取代的磺化类似物）的核酸序列。可发现适合的其它DNA类似物包括由Leumann (2002)公开的那些。序列可彼此直接邻接或通过间插DNA序列（优选至少部分双链的）而连 接。
[0016] 在优选实施方案中，穿梭蛋白为减毒的毒素蛋白。特别地，穿梭蛋白可为炭疽杆菌 致死因子结构域I(B.anthracis lethal factor domain I，LFn) 〇
[0017] 优选地，在减毒毒素中，至少一毒素结构域，如炭疽杆菌致死因子蛋白毒素的毒素 结构域II-IV中的一个或多个被核酸结合结构域所代替。例如，核酸结合结构域可为酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)GAL4(与LFn融合）。
[0018] 有利地是，反义寡核苷酸组合物进一步包括成孔蛋白。优选地，成孔蛋白为无毒性 蛋白。一种优选的成孔蛋白为炭疽杆菌毒力因子保护性抗原(Protective Antigen,PA)。具 体地，成孔蛋白可为炭疽杆菌PA83或PA63。
[0019] 在一个实施方案中（在以突触融合蛋白5(syntaxin5，Syn5)为下调目标的实例 中），寡核苷酸之一包括反义序列5'AATTTGTTTGTTGAGGCTA3'（SEQIDNo :18)。反义寡核苷 酸对的各成员包括杂交以形成蛋白结合序列的两条互补链之一(参见图1)。反义序列可为 蛋白结合序列的下游(3'）或上游(5'）（或者在产生的杂交体中存在不止一段反义序列的情 况下，为两侧）（参见图la)。
[0020] 在一个实施方案中，蛋白结合序列为CGG-Nn-CCG，其中"N"为包括嘌呤或嘧啶碱基 的任意核苷酸。适当地，蛋白结合序列为5'CGGCTGCTCTGATGCCG 3'（SEQ ID No:19)。
[0021 ]有利地，反义寡核苷酸组合物包括杂交以形成蛋白结合序列的寡核苷酸对，包括 序列5'CGGCATCAGAGCAGCCG 3'（SEQ ID No:20)。此类序列的实例为下示SEQ ID Nos 9,11 和13(实施例4)。
[0022] 在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包括蛋白结合序列和反义序列之间的侧翼序 列（参见图la)。
[0023] 有利地，用于本发明的寡核苷酸可以是磺化的，从而增加它们的稳定性。在磺化的 寡核苷酸中，寡核苷酸链中的一个或多个非桥接氧原子可被硫原子取代。磺化可通过例如 使用Beaucage试剂（3H-1,2-苯并二硫杂环戊二稀-3-酮-I，1，_二氧化物）（CieSIak等人， 2005)等的各种已知方法来实现。增加寡核苷酸稳定性的其它方式可用于本发明中：例如， Leumann(2002)中公开的那些。
[0024] 本发明还提供一种下调细胞的胞质溶胶中靶基因的表达的体外方法，所述方法使 用如上所述的反义寡核苷酸组合物将反义寡核苷酸跨细胞的膜递送。
[0025] 本发明的替代方面为如上所述的反义寡核苷酸组合物，其在下调人宫颈上皮细胞 中的人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)的基因表达的方法中使用（参见图5和实 施例7)。
[0026] 进一步的方面中，本发明提供如上所述的反义寡核苷酸组合物，其作为潜在的治 疗或预防剂，用于癌症、特别是包括宫颈癌和口腔癌在内的由人乳头瘤病毒(HPV)引起的癌 症。
[0027] 许多植物和细菌毒素（毒力因子）已进化为将大分子催化活性蛋白结构域形式的 毒素递送至细胞的胞质溶胶。实例包括霍乱毒素（Sandvig等人，2005)、蓖麻毒素 （Sandvig 等人，2010)和炭疽毒素(Gaur等人，2002)。这些物质已知在体内作用，引起人类的发病和死 亡。
[0028]本发明人已制备了已知的减毒形式的炭疽杆菌致死因子(LFn)，其中野生型结构 域II-IV(负责催化的毒性活性)已使用重组PCR移除。这些结构域（II-IV)随后被核酸结合 结构域如酿酒酵母GAL4所代替。所有这些都是本领域已知的(Gaur等人，2002)。发明人已示 出，在适宜条件下，即当两条适合的寡核苷酸杂交在一起形成包含单链反义序列和双链 (DS)蛋白结合序列的杂交体时，GAL4可间接结合至活性反义寡核苷酸。发明人已进一步示 出，可利用完整的复合体(LFn-GAL4 ::AS0)，通过其与另一蛋白PA83的相互作用而将反义寡 核苷酸移位至细胞的胞质溶胶中。值得注意的是，本发明人用来生成完