一种植物蛋白质的提取方法及植物蛋白质组学分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物蛋白质的提取方法及植物蛋白质组学分析方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质组学研究是在蛋白质组学水平上，对生命活动的功能执行体一蛋白质进行深入系统的研究，不仅有助于全景式地揭示生命活动的本质，而且对于研究疾病机制、发展预警、诊断和治疗方法均具有重要意义。而动植物样品的蛋白质提取是蛋白质组学研究的必要步骤。在蛋白质组学研究中，样品制备是最关键的步骤，直接决定后续实验的成败。在提取植物种子尤其是高油脂类种子的蛋白质时，采用常规方法不仅不能将蛋白质提取充分，而且提取的蛋白质杂质含量极高，不能得到高纯度的蛋白质;而蛋白质提取不充分会导致执行重要生物功能的低丰度蛋白质丢失，蛋白质杂质含量高则往往会导致蛋白质第一向等电聚焦实验的失败，第二向垂直板电泳也不能得到清晰的蛋白质点，最终导致整个实验的失败。为了得到高纯度的蛋白质，也可采用蛋白纯化试剂盒，但价格一般较昂贵。
【发明内容】
[0003]本申请实施例通过提供一种植物蛋白质的提取方法及植物蛋白质组学分析方法，解决了现有技术中植物种子蛋白质提取不充分和提取杂质含量高的问题，不仅能对植物种子蛋白质提取更充分而且提取纯度更高，且节省了蛋白质提纯费用和时间。
[0004]为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案:
[0005]—方面，本发明实施例提供了一种植物蛋白质的提取方法，包括以下步骤:
[0006](1)将植物样品研磨成粉末，再和提取液进行混合，向混合液中放入研磨珠后进行振动，再静置；
[0007](2)将静置后的混合液离心，弃上清液，将沉淀先采用第一丙酮溶液洗涤至纯白色，再采用第二丙酮溶液进行提纯，将提纯后的沉淀真空冷冻干燥，即得到蛋白质干粉。
[0008]作为优选，所述植物样品为植物种子。
[0009]作为优选，所述植物样品为高油脂类植物种子。
[0010]作为优选，所述步骤(2)中进行所述洗涤时，先向沉淀中加入第一丙酮溶液，再振动、静置、离心，对离心后的沉淀按照相同的方法重复洗涤，直至沉淀为纯白色。
[0011]作为优选，所述步骤(2)中进行所述提纯时，先向纯白色沉淀中加入第二丙酮溶液，再振动、静置、离心，离心得到的沉淀即为提纯后的沉淀。
[0012]作为优选，进行所述振动时，将混合液和研磨珠放入研磨罐或离心管中，再将研磨罐或离心管放入研磨仪内，采用研磨仪进行振动。
[0013]作为优选，所述研磨珠的直径为研磨罐直径或离心管管口直径的1/3-2/3，研磨珠的数量为1-2个。
[0014]作为优选，所述振动的频率为1500-2500次/分钟。
[0015]作为优选，所述振动的时间为2-10min。
[0016]作为优选，所述研磨珠的材质选自二氧化锆、硬质钢、不锈钢、碳化钨、玛瑙或聚酰胺纤维中的一种;所述研磨罐的材质选自二氧化锆、硬质钢、不锈钢、碳化钨、玛瑙或聚酰胺纤维中的一种;所述离心管的材质选自二氧化锆、硬质钢、不锈钢、碳化钨、玛瑙或聚酰胺纤维中的一种。
[0017]另一方面，本发明实施例还提供了一种植物蛋白质组学分析方法，包括对植物蛋白质的提取，所述对植物蛋白质的提取采用上述的提取方法。
[0018]本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点:
[0019]本发明实施例通过采用研磨仪对植物样品提取混合液进行振动，使植物样品能与提取液充分接触，使植物样品中的蛋白质充分沉淀并充分释放包裹在颗粒中的杂质，从而使蛋白质的提取更充分并减少了提取的蛋白质中的杂质含量，避免了使用价格昂贵的蛋白纯化试剂盒，节省了蛋白质提纯费用;对蛋白质提取混合液进行振动的时间短且操作简便、成本较低，节省了提取时间和提取成本。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例和对比例提取的蛋白质的双向电泳图谱。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0022]实施例1
[0023](1)称取0.25g去壳棉花种子，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，装入2mL离心管中，再加入1.2mL-20°C预冷的TCA(三氯乙酸)-丙酮提取液进行混合，该提取液为含有质量分数为10 %的TCA、质量分数为0.07 %的β_巯基乙醇以及摩尔浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的体积为棉花种子粉末体积的3倍，向混合液中放入1个研磨珠后，将离心管置于研磨仪中振动2min，再置于-20°C的环境中静置过夜，其间振荡多次，其中离心管的材质为聚丙烯，研磨珠的材质为二氧化锆，研磨珠直径为5mm，振动频率为1800次/分钟；
[0024](2)将上述静置过夜后的混合液于4°C的条件下以25000 Xg的离心力离心30min，弃上清液，向离心管内的沉淀中加入1.2mL-20°C预冷的第一丙酮溶液混合，该第一丙酮溶液为含有质量分数为0.07%的β-巯基乙醇和摩尔浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，将离心管置于研磨仪中振动2min(此时研磨珠仍在离心管内)，振动频率为1800次/分钟，再置于_20°C的环境中静置lh，然后于4°C的条件下以25000Xg的离心力离心30min，对离心后的沉淀按照相同的方法重复洗涤，直至沉淀为纯白色;再向离心管内的纯白色沉淀中加入1.2mL-20°C预冷的第二丙酮溶液，该第二丙酮溶液为丙酮体积分数为80%的丙酮水溶液，然后将离心管置于研磨仪中振动2min(此时研磨珠仍在离心管内)，振动频率为1800次/分钟，再置于_20°C的环境中静置lh，于4°C的条件下以25000Xg的离心力离心30min，最后将离心得到的沉淀真空冷冻干燥成干粉，该干粉即为棉花种子蛋白质干粉，保存备用或进行后续操作。
[0025]实施例2
[0026](1)称取0.25g油葵种子，加入0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，装入2mL离心管中，再加入1.2mL-20°C预冷的TCA-丙酮提取液进行混合，该提取液为含有质量分数为10%的TCA、质量分数为0.07%的β-巯基乙醇以及摩尔浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的体积为油葵种子粉末体积的3倍，向混合液中放入1个研磨珠后，将离心管置于研磨仪中振动5min，再置于-20°C的环境中静置过夜，其间振荡多次，其中离心管的材质为聚丙烯，研磨珠的材质为碳化钨，研磨珠直径为5mm，振动频率为2500次/分钟；
[0027](2)将上述静置过夜后的混合液于4°C的条件下以25000 Xg的离心力离心30min，弃上清液，向离心管内的沉淀中加入1.2mL-20°C预冷的第一丙酮溶液混合，该第一丙酮溶液为含有质量分数为0.07%的β-巯基乙醇和摩尔浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，将离心管置于研磨仪中振动5min(此时研磨珠仍在离心管内)，振动频率为2500次/分钟，再置于_20°C的环境中静置lh，然后于4°C的条件下以25000Xg的离心力离心30min，对离心后的沉淀按照相同的方法重复洗涤，直至沉淀为纯白色;再向离心管内的纯白色沉淀中加入1.2mL-20°C预冷的第二丙酮溶液，该第二丙酮溶液为丙酮体积分数为80%的丙酮水溶液，然后将离心管置于研磨仪中振动5min(此时研磨珠仍在离心管内)，振动频率为2500次/分钟，再置于_20°C的环境中静置lh，于4°C的条件下以25000Xg的离心力离心30min，最后将离心得到的沉淀真空冷冻干燥成干粉，该干粉即为油葵种子蛋白质干粉，保存备用或进行后续操作。
[0028]实施例3
[0029](1)称取6.25g花生种子，加入1.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，装入50mL研磨罐中，再加入30mL-20°C预冷的TCA-丙酮提取液进行混合，该提取液为含有质量分数为10%的TCA、质量分数为0.07%的β-巯基乙醇以及摩尔浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的体积为花生种子粉末体积的3倍，向混合液中放入2个研磨珠后，将研磨罐置于研磨仪中振动lOmin，再置于-20°C的环境中静置过夜，其间振荡多次，其中研磨罐的材质为不锈钢，研磨珠的材质为不锈钢，研磨珠直径为10mm，振动频率为1500次/分钟；
[0030](2)将上述静置过夜后的混合液和研磨珠一起转移到离心管中，并于4°C的条件下以25000Xg的离心力离心30min，弃上清液，向离心管内的沉淀中加入30mL-20°C预冷的第一丙酮溶液混合，该第一丙酮溶液为含有质量分数为0.07%的β-巯基乙醇和摩尔浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，将离心管内的混合液和研磨珠转移到研磨罐中，并置于研磨仪中振动lOmin，振动频率为1500次/分钟，再置于-20°C的环境中静置lh，然后将混合液和研磨珠一起转移到离心管中，并于4°C的条件下以25000 Xg的离心力离心30min，对离心后的沉淀按照相同的方法重复洗涤，直至沉淀为纯白色;再向离心管内的纯白色沉淀中加入30mL-20°C预冷的第二丙酮溶液，该第二丙酮溶液为丙酮体积分数为80 %的丙酮水溶液，然后将离心管内的混合液和研磨珠转移到研磨罐中，并置于研磨仪中振动lOmin，振动频率为1500次/分钟，再置于-20°C的环境中静置lh，然后将混合液和研磨珠一起转移到离心管中，并于4°C的条件下以25000 Xg的离心力离心30min，最后将离心得到的沉淀真空冷冻干燥成干粉，该干粉即为花生种子蛋白质干粉，保存备用或进行后续操作。
[0031 ] 实施例4
[0032](1)称取6.25g大豆种子，加入1.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及液氮，迅速研磨成粉末，装入50mL研磨罐中，再加入30mL-20°C预冷的TCA-丙酮提取液进行混合，该提取液为含有质量分数为10%的TCA、质量分数为0.07%的β-巯基乙醇以及摩尔浓度为lmmol/L的苯甲基磺酰氟的丙酮溶液，其中提取液的体积为大豆种子粉末体积的3倍，向混合液中放入2个研磨珠后，将研磨罐置于研磨仪中振动8min，再置于-20°C的环境中静置过夜，其间振荡多次，其中研磨罐的材质为玛瑙，研磨珠的材质为玛瑙，研磨珠直径为10mm，振动频率为2000次/分钟；
[0033](2)将上述静置过夜后的混合