重组蓖麻毒素b链截短蛋白及其表达方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种重组蓖麻毒素 B链截短蛋白及其表 达方法和应用。
【背景技术】
[0002] 蓖麻毒素(ricin)是一种异源二聚体糖蛋白，由A链(RTA)和B链(RTB)组成，两条链 通过二硫键连接。RTA是一种核糖体灭活蛋白，在哺乳动物细胞内可抑制蛋白质合成。RTB无 毒，具有凝集素活性，协助A链进入细胞内发挥生物学功能。RTB是一个两叶形结构的分子， 由两个相同折叠的拓扑学球状结构域构成，每一个区域又包括三个亚区（α，β，γ )，只有Ια 和2β有明显的半乳糖结合活性，RTB可以结合不同的糖结构，调解各种生物过程，包括细胞 与宿主、病原体相互作用和先天免疫反应。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有重组蓖麻毒素 B链蛋白复性率低、复性蛋白稳定性差等技术问题，本 发明提供一种重组蓖麻毒素 B链截短蛋白及其表达方法和应用。
[0004] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0005] 本发明提供一种重组蓖麻毒素 B链截短蛋白，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。
[0006] 进一步的，蓖麻毒素 B链蛋白基因中具有9个半胱氨酸，将蓖麻毒素 B链蛋白的氨基 酸序列中前五位氨基酸截短，得到蓖麻毒素 B链截短基因序列，并用该蓖麻毒素 B链截短基 因序列进行蛋白质重组表达，从而获得重组蓖麻毒素 B链截短蛋白。
[0007] 本发明还提供了上述重组蓖麻毒素 B链截短蛋白的表达方法，包括以下步骤：
[0008] (1)大肠杆菌表达工程菌BL21 (DE3)/PET28a-RTB的获得
[0009] 在氨基酸序列不变的条件下，根据已有的蓖麻毒素 B链序列进行密码子优化，并通 过人工合成蓖麻毒素 B链密码子优化后的全序列，其核苷酸序列为序列表中的序列1，其氨 基酸序列为序列表中的序列2;
[0010] 以蓖麻毒素 B链密码子优化后的全序列为模板，用rRTB sense primer和rRTB anti-sense primer进行PCR扩增，获得的PCR产物连接至pMD18-T克隆载体，获得pMD18T-RTB；
[0011] 双酶切PMD18T-RTB和PET-28a表达载体，将酶切产物链接并转入大肠杆菌感受态 细胞BL21 (DE3)，经筛选获得阳性菌BL21 (DE3) /PET28a-RTB，提取质粒PET28a-RTB并测序；
[0012] (2)重组蓖麻毒素 B链截短蛋白的诱导表达与纯化
[0013] 将阳性菌BL21(DE3)/PET28a-RTB按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100ug/mL Kan的LB培养基中，37°C下、180rpm恒温振荡培养至0D 6Q() = 0.6时，再按1:100v/v的比例转接 至500mL同样的LB培养基中，并补加 Kan至终浓度为100ug/mL，37°C下、180rpm恒温振荡培养 至0D6q() = 0.6;诱导组添加 IPTG至终浓度为ImM，37°C下、180rpm恒温振荡诱导16h;经诱导 16h后，4°C下、8000rpm离心获得菌体沉淀；
[0014]用大肠杆菌细菌裂解试剂盒裂解菌体沉淀，离心获得包涵体沉淀;将包涵体沉淀 用8M尿素溶解后加2X SDS-PAGE上样缓冲液，100°C下煮沸5min，吸取样品进行SDS-PAGE电 泳;经12 % SDS-PAGE电泳分析，重组蓖麻毒素 B链截短蛋白在包涵体有特异性的表达，且其 蛋白分子量为38Kd，与预期的蛋白大小相符合。
[0015] 进一步的，步骤（1)中，PCR扩增条件为:预变性94°C: 5min、变性:94°C30s、退火:60 °C30s延伸：72°C45s共扩增25循环。
[0016] 进一步的，步骤（2)中，所述2X SDS-PAGE上样缓冲液包括：PH6.8的100mmol/L Tris · Cl、200mmol/mL DTT、4%SDS、0.2%溴酚蓝和20%甘油。
[0017] 进一步的，还包括步骤(3):将步骤(2)获得的包涵体溶解液进行亲和层析，亲和层 析柱为cOmplete His-Tag Purification Resin Ni2+，洗脱液为含500mM咪唑的8M尿素，当 咪唑浓度为300mM时，收集洗脱峰即为纯化后的重组蓖麻毒素 B链截短蛋白。
[0018] 本发明提供了重组蓖麻毒素 B链蛋白作为疫苗佐剂的应用。
[0019] 本发明的有益效果是:本发明的重组蓖麻毒素 B链复性率提高，稳定性增强，免疫 原性好，增强疫苗免疫效果、降低疫苗用量，可作为灭活疫苗、减活疫苗、裂解疫苗、DNA疫 苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等多种疫苗的佐剂。
【附图说明】
[0020] 图1为免疫后狂犬病中和抗体水平。
【具体实施方式】
[0021] 本发明提供一种重组蓖麻毒素 B链截短蛋白，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。
[0022] 蓖麻毒素 B链蛋白基因中具有9个半胱氨酸，将蓖麻毒素 B链蛋白的氨基酸序列中 前五位氨基酸截短，得到蓖麻毒素 B链截短基因序列，并用该蓖麻毒素 B链截短基因序列进 行蛋白质重组表达，从而获得重组蓖麻毒素 B链截短蛋白。
[0023] 本发明提供了一种重组蓖麻毒素 B链截短蛋白的表达方法，通过大肠杆菌表达系 统表达重组蓖麻毒素 B链截短蛋白。
[0024]经SDS-PAGE电泳分析，两种方法表达的重组蓖麻毒素 B链截短蛋白在包涵体有特 异性的表达，且其蛋白分子量为38Kd，与预期的蛋白大小相符合。
[0025] 本发明提供了重组蓖麻毒素 B链蛋白作为疫苗佐剂的应用，通过重组蓖麻毒素 B链 截短蛋白作为疫苗佐剂增强狂犬疫苗免疫效果试验以及重组蓖麻毒素 B链截短蛋白作为疫 苗佐剂增强流感病毒疫苗免疫效果试验证明：本发明的重组蓖麻毒素 B链蛋白作为疫苗佐 剂可以增强疫苗免疫效果。
[0026] 实施例1大肠杆菌表达系统表达重组蓖麻毒素 B链截短蛋白
[0027] 1、大肠杆菌表达工程菌BL21(DE3)/PET28a-RTB的获得
[0028]在氨基酸序列不变的条件下，根据已有的蓖麻毒素 B链(rRTB)序列进行密码子优 化，具体的是:蓖麻毒素 B链蛋白基因中具有9个半胱氨酸，将其氨基酸序列中前五位氨基酸 截短，得到蓖麻毒素 B链截短基因序列，并通过人工合成蓖麻毒素 B链密码子优化后的全序 列，其核苷酸序列为序列表中的序列1，其氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0029]根据上述的蓖麻毒素 B链密码子优化后的全序列作为模板，用rRTB sense primer (序列3)和rRTB anti-sense primer(序列4)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下:预变性94°C: 5min、变性：94°C30s、退火：60°C30s延伸：72°C45s共扩增25循环。获得的PCR产物连接至 PMD18-T克隆载体(宝生物工程(大连)有限公司），获得pMD18T-RTB。
[0030] 用EcoR I和Hind III双酶切PMD18T-RTB回收小片段，与经过同样EcoR I和Hind III双酶切的PET-28a表达载体链接，得到的链接产物转入大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)， 经筛选获得阳性菌，对阳性菌提取质粒后进行测序，结果该质粒为序列表中序列1插入 PET28a表达载体的EcoR I和Hind III的酶切位点间得到的质粒，将该质粒命名为PET28a-RTB，其对应的阳性菌命名为BL21 (DE3) /PET28a-RTB。
[0031] 2、重组蓖麻毒素 B链截短蛋白的诱导表达与纯化
[0032] 将上述获得的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-RTB按1:100v/v的比例接种于5mL含Kan (浓度为l〇〇ug/mL)的LB培养基(配方:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，在37 °C下，180rpm恒温振荡培养至0D6qq = 0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培 养基(配方:蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，并补加 Kan至终浓度为100ug/ mL，同上述培养条件即在37°C下，180rpm恒温振荡培养至0D6Q() = 0.6;诱导组添加 IPTG至终 浓度为ImM，同上述培养条件即在37°C下，180rpm恒温振荡诱导16h;经诱导16h后，在4°C下， 8000rpm离心获得菌体沉淀。
[0033]获得的菌体沉淀用大肠杆菌细菌裂解试剂盒裂解，离心获得包涵体沉淀;将包涵 体沉淀用8M尿素(配方:Tris 50mmol/mL，尿素8mol/L，NaCl 0.5111〇1/1]11^!1=8.0)溶解后加 2X SDS-PAGE上样缓冲液（配方：100mmol/L Tris.Cl(pH6.8)、200mmol/mL DTT、4%SDS、 0.2%溴酚蓝、20%甘油），在100°C下煮沸5min，吸取20ul样品，进行SDS-PAGE电泳。
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