水稻水通道蛋白OsPIP1；1及其基因的新应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物基因工程领域，具体涉及水稻水通道蛋白〇sPIPl;l@ryza ytiva ￡lasma membrane intrinsic [rotein 1;1)及其编码基因和在调控水稻和酵母锦 积累方面的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国重要的粮食作物，也是重金属镉(Cd)富集农作物之一。近年来，我国土 壤污染状况十分严重，其中以土壤镉污染最为突出。土壤中的镉被农作物吸收，并通过食物 链富集于人体的肾脏、肝脏等器官造成毒害，并引起人体内骨质钙流失，严重危害人体健 康。
[0003] 水稻是一种重金属镉富集的农作物。2014年4月，国土资源部和环境保护部公布数 据表明，我国土地的重金属污染十分严重，按照点位超标率计算，我国土壤中镉超标的土地 已达我国国土总面积的7%。按照污染发生的地区来看，重金属污染则主要分布于我国的华 中华南地区、泛珠三角地区、长三角地区及东北地区，这些地区均为我国水稻的主要产区， 严重影响我国的水稻粮食安全。近年来，由媒体报道的稻米镉超标事件层出不穷，引起了民 众巨大的恐慌。克隆和分离水稻体内的镉胁迫应答和解毒基因，具有重要的意义和潜在的 应用价值。〇sPIPl;l是水稻中的水通道蛋白之一。水通道蛋白首次在人类红细胞中得以鉴 定，主要介导水分子的跨膜转运，该项发现于2003年获得了诺贝尔化学奖。植物水通道蛋白 (Aquaporin，AQP)是位于细胞质膜和内膜上的水分子通道蛋白（water channel protein)， 同时也可跨膜运输甘油、尿素、C02、氨气、H202等小分子和硅、砷、硼、硒、锑等类金属。植物水 通道蛋白参与应答包括盐胁迫、干旱和冷胁迫等多种非生物胁迫，这类胁迫应答主要与维 持细胞内水平衡相关;近期的研究发现，部分植物水通道蛋白成员在类金属的跨膜转运和 维持细胞内类金属内稳态方面发挥重要作用。
[0004] 在本发明中，我们描述了水稻水通道蛋白0sPIPl;l基因的表达能够影响重金属镉 在生物体内的积累，提供了将该基因应用于重要粮食作物一一水稻的低镉遗传育种技术， 本发明也可应用于工程菌一一酿酒酵母的低镉遗传改造。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种水稻水通道蛋白OsPIPl; 1及其编码基因 OsPIPl; 1的新应用。
[0006] 实现上述目的的技术方案如下。
[0007] 氨基酸序列如SEQ ID N0.2的水稻水通道蛋白OsPIPl ;1和/或OsPIPl ;1基因在水 稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsPIP1; 1基因的cDNA为如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列，或为与SEQ ID NO. 1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。
[0008] 本发明的水稻胰蛋白酶抑制剂OsPIPl ;1，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其编 码基因 OsPIPl;l的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在 不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保 护范围内。
[0009] 本发明的另一的是提供一种RNAi片段的表达载体，该表达载体克隆有上述针对水 稻水通道蛋白基因 OsP IP 1; 1的RNAi片段。使用该RNAi载体在水稻体内转基因，可用于培育 水稻低镉品种。
[0010] 实现该目的的技术方案如下。
[0011]插入有核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的核苷酸片段的RNAi表达载体。
[0012] 优选地，所述表达载体为PTCK303。
[0013] 本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的制备方法。
[0014] 实现该目的的技术方案如下。
[0015] RNAi表达载体的制备方法，包括有以下步骤：
[0016] (l)将核苷酸序列如SEQIDN0.3所示的核苷酸片段连接于pGEMT-Vector上形成 pGEMT-PIPRI；
[0017] (2)用SacI和Spel双酶切pGEM T-PIPRI，回收得到片段F1，同时用SacI和Spel双酶 切载体PTCK303,将回收后的F1片段与经SacI和Spel双酶切处理后的pTCK303载体连接，形 成PTCK303-PIPRI-F1;
[0018] (3)用BamHI和ΚρηΙ双酶切pGEM T-PIPRI并回收得到片段F2,然后将片段F2与 BamHI和ΚρηΙ双酶切处理后pTCK303-PIPRI-Fl载体连接，即得。
[0019] 优选地，核苷酸序列如SEQ ID Ν0.3所示的核苷酸片段，通过以下方法得到：以水 稻基因组DNA为模板，以SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5为引物，进行扩增，回收扩增产物。
[0020] 本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的应用。
[0021] 实现上述目的的技术方案如下。
[0022] 上述RNAi表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。其可用于培育水稻低镉品 种。
[0023] 本发明的另一目的是提供一种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂。
[0024] 实现上述目的的技术方案如下。
[0025] -种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份为上述的RNAi表达载体， 或含有0sPIPl;l基因。
[0026] 上述的0sPIPl;l基因、水稻超表达载体和/或RNAi表达载体，可以制备成生物制 剂，用于降低水稻中重金属镉积累，用于水稻的低镉遗传育种。
[0027]本发明的另一目的是提供一种降低水稻中重金属镉积累的方法。
[0028]实现上述目的的技术方案如下。
[0029] 一种降低水稻中重金属镉积累的方法，该方法步骤中包括调控0sPIPl;l基因的表 达，所述0sPIPl;l基因的cDNA为如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID N0.1互 补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0030]本发明的有益效果如下：
[0031 ] 在本发明中，我们通过对筛选文库获得的OsPIPl ; l@ryza ptiva Elasma membrane intrinsic protein 1;1)基因的进一步研究，发现该基因具有以下应用：（1)该 基因在酿酒酵母中的超量表达能够降低酵母细胞对重金属镉的积累，促进酵母体内镉的外 排；（2)通过将OsPIPl; 1基因在水稻中RNAi，降低转基因水稻株系中OsPIPl; 1基因的表达 量，可以影响转基因水稻种子中镉含量，得到低镉富集的转基因水稻品系。该基因可应用于 工程菌及水稻针对体内镉含量改变的遗传工程育种，也可应用于其他植物的针对体内镉富 集的遗传工程育种。
【附图说明】
[0032] 图1示构建完成的酿酒酵母重组表达载体OsPIPl; l-pYES2示意图。
[0033]图2示转化OsPIPl; l-pYES2的转基因酵母在含镉培养基中生长后镉积累降低。 [0034] 图3示构建完成的水稻转基因 RNA干涉载体OsPIPl; l-pTCK303示意图。
[0035] 图4示水稻OsPIPl; 1转基因 RNAi植株的qRT-PCR检测。
[0036] 图5示野生型水稻种子和OsPIPl; 1转基因 RNAi水稻种子中镉含量的比较。
【具体实施方式】
[0037] 本发明主要阐述OsPIPl ;1基因在调控镉积累生物工程方面的应用。本发明以水稻 日本晴品种幼苗叶片为材料提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，设计引物 PIPF: 5 ' -ATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3 ' 和PIPR: 5 ' -TTAAGACCTGCTCTTGAATGG-3 '，并采用高保 真的Taq酶扩增OsPIPl; 1基因的cDNA阅读框全长，回收得到的片段连接于pGEM T-vector， 形成OsPIPl ;l-pGEM T重组质粒，并测序。OsPIPl ;1基因在水稻基因组数据库(MSU Rice Genome Annotation Project Database and Resource,http:// rice .plantbiology .msu · edu/index · shtml)中的编号为L0C_0s02g44630，命名为OsPIPl; 1 (Qryza ytiva Elasma membrane Intrinsic Er〇tein 1; 1)。该基因编码一个包含87〇个 丰i苷酸的开放阅读框，其序列如SEQ ID NO. 1所示。其编码蛋白具有289个氨基酸残基，其序 列如SEQ ID N0.2所示。
[0038] 在本发明中，通过构建酵母转基因超表达载体OsPIPl; l-pYES2,并将该载体转化 酿酒酵母，通过该基因在酵母体内的诱导表达，可以降低酵母对重金属镉的积累。用于构建 酵母表达载体的引物为OsPIPl; 1YEF: 5 ' -TACCGAGCTCGGATCCATGGAGGGGAAGGAGGAGGAC-3 ' 和 OsPIPl; 1YER:5'-TAGATGCATGCTCGAGTTAAGACCTGCTCTTGAATGG_3'。通过该对引物以重组质 粒OsPIPl; 1-pGEM T为模板，采用高保真Taq酶PCR扩增OsPIPl; 1基因的cDNA阅读框片段，回 收的DNA片段插入酵母表达载体pYES2的BamHI和Xhol酶切位点之间。经测序验证正确后，即 形成OsPIPl; 1基因在酵母中的转基因诱导超表达载体OsPIPl; 1-p YES2(如图1所示）。将该 重组载体OsPIPl; 1-PYES2采用醋酸锂的方法转化进入酿酒酵母中，采用诱导的极限培养基 (添加半乳糖)培养酵母转化子克隆，以转化PYES2空载体的酵母菌株为对照，30°C培养酵母 至0D600为1.5-2，然后在培养基中添加1(^1和3(^1的0(1(：1 2，重新培养24小时，离心收获酵 母细胞，用双蒸水清洗3遍，65°C干燥3-5天，干燥的酵母块将微波消解后，采用火焰法原子 吸收光谱测定酵母细胞中镉的积累。
[0039]本发明还描述了将OsPIPl ;1基因用于水稻的低镉转基因育种。水稻是一种淹水地 栽培的农作物，对水分的需求极其旺盛，而水通道蛋白主要负责对水的吸收和转运，因此水 稻体内的水通道基因对水稻的正常生长及其重要。在本发明中，我们首次将水稻的水通道 蛋白基因和水稻对重金属镉的积累联系起来，通过RNAi技术下调OsPIPl;l基因在水稻中的 表达，可以获得稻米中低富集镉的水稻转基因品系。
[0040]本发明中，用于构建水稻转基因RNA干涉载体为pTCK303,该载体来源于 PCAMBIA1301。以重组质粒OsPIPl; 1-pGEM T为模板进行PCR扩增。设计引物为OsPIPl; 1RIF: S'-GGGGTACCACT