一种高纯度胶原蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质的制备领域，具体涉及一种高纯度胶原蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是一种纤维蛋白（fibrous protein)，其可在软骨、筋腱、真皮组织以及 其它结缔组织中发现。
[0003] 目前，胶原蛋白已广泛运用于工业以及医药，它一般藉由可将非胶原蛋白物质移 除的反复酸溶或酵素处理，而由结缔组织纯化出来;此种处理需重复数次以改善胶原蛋白 的纯度。重复处理不仅会拉长纯化工艺，更会导致胶原蛋白产率低。公开号为CN 102131403A的中国发明专利公开了一种新颖的胶原蛋白制备方法，通过先制造胶原蛋白基 质，然后再由基质萃取出胶原蛋白，这种方法避免了制备过程中的重复操作，然而造胶原蛋 的纯度仍有改善空间。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它 依次包括以下步骤：
[0006] (a)选取动物身上的结缔组织；
[0007] (b)将所述结缔组织浸入第一酸液中，使其体积至少膨胀一倍形成膨胀结缔组织；
[0008] (c)清洗所述膨胀结缔组织，形成胶原蛋白基质；
[0009] (d)利用萃取液从所述胶原蛋白基质萃取出胶原蛋白，形成含有胶原蛋白的溶液；
[0010] (e)将所述含有胶原蛋白的溶液倾入盐溶液中，得到胶原蛋白沉淀；
[0011] (f)将所述胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析，取出干燥即可。
[0012] 优化地，步骤(c)中，采用清洗液对所述膨胀结缔组织进行清洗，所述清洗液中包 含以下重量份数的原料： 水 100~150份：
[0013] 表面活性剂 1~10份； 螯合剂 1~10份； 蛋白水解酶 1~10份;
[0014] 1-甲基-3-乙基咪唑氯鑰盐 0,1~1份； 氯化钠 1~5份。
[0015] 优化地，所述步骤(a)中，采用人工或机械清理结缔组织除去脂肪和脂质。
[0016] 优化地，步骤(b)中，所述第一酸液中包含甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸和苹果酸 中的一种和多种，其浓度为0.5~3mol/L。
[0017] 优化地，步骤⑷中，所述萃取液包含有机弱酸或/和无机盐的溶液，其pH值为3~ 7〇
[0018] 优化地，步骤(e)中，所述盐溶液的浓度为0.3~2mol/L，其体积与所述含有胶原蛋 白的溶液体积比为5~10:1。
[0019] 优化地，步骤(f)中，所述清水每30~60分钟更换一次，透析时间为3~5小时。
[0020] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明高纯度胶 原蛋白的制备方法，通过将含有胶原蛋白的溶液倾入盐溶液中沉淀并进行透析，这样能够 得到高纯度胶原蛋白；并且采用特定的清洗剂，能够提高得到的胶原蛋白基质纯度，从而为 得到高纯度胶原蛋白打下基础。
【具体实施方式】
[0021] 本发明高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：（a)选取动物身上的结 缔组织，结缔组织选取的表面积为20平方毫米(mm 2)至2平方米(m2);起始材料（即结缔组织） 取自于动物，例如牛、猪、马、羊、鸡、鸭、火鸡、鹅、鲸鱼或者鲨鱼等畜类或鱼类，具体部位为 真皮组织、皮下组织、韧带、筋腱、腱膜、软骨以及骨头组织等;在取用时可先用人工切开或 机械清理结缔组织以除去不需要的材料，例如脂肪及脂质。如将动物皮除去脂质、以盐水清 洗皮数次后，以一植皮刀除去动物皮的表面层即可获得真皮组织，所得的真皮组织可用磷 酸盐缓冲溶液进一步清洗。根据需要，结缔组织可以先用适合的有机溶剂(如醇、酮、丙酮、 乙腈、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或其混合物)或者有机溶剂与水的混合液(其体积 比为1:1~5)进行处理，使有机溶剂可以渗透入结缔组织；当结缔组织含有毛发或毛根时， 可以用微碱溶液或蛋白水解酶处理以除去毛发或毛根，蛋白水解酶可为分散酶、胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凤梨蛋白酶、无花果蛋白酶或其混合物。
[0022] (b)将所述结缔组织浸入第一酸液中，使其体积至少膨胀一倍形成膨胀结缔组织； 第一酸液为有机酸，例如甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸或其混合物，其浓度为0.5 ~3mol/L;醋酸效果较佳;为了获得较佳的膨胀效果，可以在其中加入清洗液中含有的表面 活性剂，使其浓度为〇. 1~〇. 5mol/L。
[0023] (c)清洗所述膨胀结缔组织，形成胶原蛋白基质;步骤(c)中，采用清洗液对所述膨 胀结缔组织进行清洗，所述清洗液中包含以下重量份数的原料:水100~150份、表面活性剂 1~10份、螯合剂1~10份、蛋白水解酶1~10份、1 -甲基-3-乙基咪唑氯鐵盐0.1~1份和氯化 钠1~5份，以得到高纯度胶原蛋白基质。表面活性剂选用常规的即可，如十二烷基硫酸钠 (SDS)、Tego化合物、氯化十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲基铵等；螯合剂选用常规的即 可，如乙二胺四乙酸化0了六）、1，4,7，10-四氮杂环十二烷基-1，4,7，10'-四乙酸(0(^4)、1，4， 7，10-四氮杂环十二烷基_1，4,7，10'-四亚甲基磷酸(0(^)等。蛋白水解酶可以采用无花果 蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、分散酶以及溶血素，以除去连接于细胞外基质的蛋白质、其它 非胶原蛋白的蛋白质与胶原蛋白分子的末端肽。
[0024] (d)利用萃取液从所述胶原蛋白基质萃取出胶原蛋白，形成含有胶原蛋白的溶液； 可以将前述的胶原蛋白基质进行研磨、震荡、搅拌、均质化、绞碎、撕裂、切割、磨碎、切或其 混合方式使其有利于在萃取液中的溶解;随后将处理过的胶原蛋白基质浸于萃取液中，并 对其进行震荡、搅动或搅拌使得萃取液能够溶解最大量的胶原蛋白，过滤除去未溶解的部 分;该萃取液包含有机弱酸或/和无机盐的溶液，其pH值为3~7;弱酸为甲酸、草酸、醋酸、柠 檬酸、乳酸、苹果酸、硼酸、磷酸或其混合物;无机盐包含氯化钠或/和氯化钾，其浓度为0.1 ~2mol/L〇
[0025] (e)将所述含有胶原蛋白的溶液倾入盐(也是氯化钠或/和氯化钾)溶液中，得到胶 原蛋白沉淀;盐溶液的浓度为0.3~2mol/L，其体积与含有胶原蛋白的溶液体积比为5~10: 1〇
[0026] (f)将所述胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析3~5小时，取出干燥 即可;清水每30~60分钟更换一次。
[0027] 下面将结合实施例对本发明进行进一步说明。
[0028] 实施例1
[0029] 本实施例提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：
[0030] (a)自猪身上取得皮肤组织，除去脂质后，以盐水清洗皮数次，以植皮刀除去皮的 表皮层以获得厚度为〇. 3_的真皮组织;随后用磷酸盐缓冲溶液清洗该真皮组织，将缓冲溶 液残余物自真皮组织的表面完全的除去；
[0031] (b)将上面的真皮组织浸入盛有浓度为0.5mol/L的醋酸溶液的容器内，在40°C恒 温放置48h使真皮组织膨胀至厚度为0.6毫米；
[0032] (c)用清洗液清洗膨胀结缔组织，该清洗液中包含以下重量份数的原料:水100份、 表面活性剂1份、螯合剂1份、蛋白水解酶1份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鑰盐0.1份和氯化钠1 份;从而形成胶原蛋白基质；
[0033] (d)将胶