棘孢木霉h2及其在降解芘中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一株新的微生物及其在降低污染物中的应用，特别涉及棘孢木霉H2及其在降解芘中的应用。
【背景技术】
[0002]PAHs由两个或两个以上苯环以线性排列、弯接或簇聚的方式构成的。一般可分为两类，即孤立多环芳烃和稠合多芳烃。稠合多环芳烃对人类的威胁较大，有致癌作用的多环芳烃多为四到六环的稠环化合物。大多数PAHs不溶于水，熔点高达101°C?438°C，沸点150°C?525°C，分子量在178?300之间。双环、三环的PAHs易降解，四环以上的PAHs极难降解。研究结果表明:在室内环境下，双环PAHs的半衰期为2天;三环的半衰期为:16天(蒽)，134天(菲)；而四环以上的PAHs半衰期约在200天以上。
[0003]PAHs的基本结构单位是苯环，苯环的数目和连接方式的不同引起分子量、分子结构变化，进而导致了某些不同的物理化学性质。PAHs具有致诱变性，且结构稳定，生物难降解。1979年，美国环保局(EPA)首先公布129种优先监测污染物，其中PAHs有16种。而后欧洲将6种PAHs作为目标污染物，我国国家环保局也将7种PAHs列入中国环境优先污染物黑名单。
[0004]环境中的PAHs来源主要来自人类的生产活动，由各种有机物不完全燃烧所致。例如，煤的汽化和液化过程、石油的裂解过程、各种石油馏份的燃烧、烹调油烟以及废弃物等均可造成环境中PAHs的污染。四环以下分子量较小的PAHs多以蒸气态存在，而分子量较大的则被吸附在颗粒物表面，尤其是在小于5μπι的颗粒上，可以进入肺的深部。这样的颗粒可以在空气中悬浮几天到几周，也能远距离转移。
[0005]PAHs不易溶于水，极易附着在固体颗粒上，因此，大气、水及土壤中PAHs处于吸附态。PAHs在环境中是不断积累的。研究表明在河水、海水沉积物中，PAHs的浓度高而且积累的快。因排废气、废水及废物倾倒，PAHs对水、大气及土壤产生直接污染。吸附在烟气微粒的PAHs随气流传向周围及更远处，又随降尘、降雨及降雪进入水体及土壤，而土壤及地面多环芳烃通过扬尘再次进入大气，通过呼吸及食物链进入动物体产生毒害。
[0006]目前PAHs作为持久性有机污染物，因具有以下特性而被各国所关注:(l)PAHs具有极强的“三致”效应，即致癌性、致突变性及致畸性。人类及动物癌症病变有70%?90%是环境中化学物质引起的，而PAHs则是环境中致癌化学物质中最大的一类；(2)PAHs对微生物的生长有强抑制作用。PAHs因水溶性差及其稳定的环状结构而不易被生物利用，它们对细胞的破坏作用抑制普通微生物的生长；(3)PAHs经紫外照射后毒性更大(光毒效应hPAHs吸收紫外光能后，被激发成单线态及三线态分子，被激发分子的能量可以通过不同途径损失。其中一部分被激发的PAHs分子将能量传给氧，从而产生反应能力极强的单线态氧，它能损坏生物膜。
[0007]1775年，英国人发现烟囱清扫工人多患阴囊癌；1882年，又有人发现从事煤焦油和沥青作业的工人多患皮肤癌。20世纪70年代以前，人们一直以为多环芳烃是直接致癌物，后来，动物实验的结果表明，多环芳烃本身对生物并无多大负效应，它们只有被酶系统代谢，转化为多种代谢产物后，其中某些活性形式的代谢产物与DNA发生共价结合，才具有致癌作用。
[0008]而多环芳烃进入土壤后，由土壤表面污染进一步导致下层土壤污染，甚至地下水污染。多环芳烃在土壤中的迀移与转化受挥发、光解及生物降解等过程的影响，在光诱导、生物积累及生物代谢变迀过程中，多环芳烃一般转化为酚类、醌类及芳香族羧酸类物质，有的转化产物甚至比原始多环芳烃更具毒性。
[0009]以往降解PAHs菌的分离报道，很多以萘、菲等低分子量的PAHs为主。自1988年Heitkamp等首次报道从土壤中分离到1株能降解芘的菌，经鉴定为分枝杆菌属的一个新种(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)，之后高分子量PAHs的降解研究也有很多，分枝杆菌(如Mycobacterium sp.strain APInMycobacterium sp.strain RJGI1-135、Mycobacterium flavescens，红球菌(Rhodococcus sp.strain UW1)、白腐真菌(Pleurotusostreatus、Panerochaete chrysosporium)和糖丝菌(Saccharothrix sp.PYX-6)等。
[0010]PAHs的芘苯环对称排列组成，结构稳定，是高分子量PAHs的代表化合物，具有致癌、致畸的结构域，因此能降解芘的微生物资源还很有限，特别是芘降解霉菌的相关研究目前更少见报道。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供棘孢木霉H2及其在降解芘中的应用。
[0012]发明人通过大量的筛选，筛选得到了一株可降解PAHs，特别是降解芘的新菌株，经鉴定，命名该新菌株为棘孢木霉H2。棘孢木霉H2已经于2015年11月3日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏机构于2015年11月3日鉴定存活，给予保藏编号为CGMCC N0.11577，建议的分类命名为棘抱木霉(Trichoderma asperellum)。
[0013]实验数据表明棘孢木霉H2具有降解芘的能力，降解力强，可以用于PAHs的降解。
【附图说明】
[0014]图1为棘孢木霉H2在察氏培养基(25°C，7d)上的菌落形态；
图2为棘孢木霉H2在在麦芽汁培养基(25°C，7d)上的菌落形态；
图3为棘孢木霉H2在察氏酵母培养基(25°C，7d)上的菌落形态；
图4为棘孢木霉H2在不同培养基(25°C，7d)上的背面菌落形态；
图5为棘孢木霉H2的分生孢子梗；
图6为棘孢木霉H2对芘的降解曲线；
图7为棘孢木霉H2的菌丝干重增长图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0016]芘降解菌的分离与鉴定培养基配方 PDA培养基:土豆浸出物200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15_20g/L。
[0017]液体培养基:在Tienand Kirk (1988)的配方的基础上稍加改良:其中用浓度为0.02mol.L—1的乙酸缓冲液(pH=4.4)代替丁二酸二甲酯缓冲液。其中葡萄糖10g/L，KH2P04 2g/L，MgS04.7H20 0.25g/L，CaCl2 0.1 g/L，酒石酸铵0.5g/L(C4H12N206)，微量元素 10g/L，微量元素的组成(/L):
MnS04 0.5g，NaCl 1.0 g,FeS04.7H20 0.1 g，C0Cl2 0.1g,ZnS04.7H20 0.lg,CuS040.1g，AlK(S04)2.12H20 0.01g，Na2Mo04.2H20 0.0lg
接种前无菌过滤加入VB1溶液，使得最终VB1的质量浓度为5mg/L。
[0018]察氏培养基配方:30.0g/L蔗糖，3 g/LNaN03，l g/LK2HP04,0.5 g/LMgS04.7H20,
0.5 g/LKCl，0.01 g/L FeS04.7H20，15-20g/L琼脂。
[0019]麦芽汁培养基配方:20g/L麦芽浸膏，lg/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15_20g/L琼脂。
[0020]察氏酵母培养基配方:Κ2ΗΡ04 lg/L，查氏浓缩液10ml /L，酵母抽提物5g/L，蔗糖30g/L，15-20g/L 琼脂。
[0021]芘降解菌的驯化
样品采自广东省清远市，取样品蚯蚓粪，300g，含水量约50%，平摊于托盘中，添加芘使得最终艇顿中花的浓度为:第1天25mg.kg—工，4天后50mg.kg—工，8天后lOOmg.kg—S15天后200mg.kg—、添加芘的方法为:取一定量的芘溶于丙酮溶液，取芘丙酮溶液均匀喷施到土壤中，搅拌均匀，并放置通风厨待丙酮挥发完毕，在28°C，避光条件下连续驯化20天。
[0022]分离
称取已经驯化好的土样10 g，放入90