一种利用赤霉菌CA3-1合成11α,15α-diOH-坎利酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及利用一株赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1转化底物坎利酮为11α，15a-di0H_坎利酮的方法。
【背景技术】
[0002]坎利酮(Canrenone)是一种留体激素类心血管药物，临床上主要作为非选择性醛固酮受体拮抗剂来治疗心血管疾病，其能被氧化生成11α-0Η-坎利酮和lla，15a-di0H_坎利酮。lla-ΟΗ-坎利酮作为合成一种高效治疗心血管疾病的药物-依普利酮的必不可少的关键前体化合物，是当前留体药物研究领域中的热点之一，而目前对其11a，15a双羟基产物鲜有报道。与传统的化学合成方法相比，微生物转化技术具有反应步骤少、条件温和、立体选择性高、以及环境友好等众多优势。利用微生物转化技术，可选择性的在坎利酮母核的不同位点引入一个或多个轻基，合成多种留体医药中间体，用于生产多种抗炎药物。由于留体化合物独特的生物活性和药用价值，国家已把留体激素药物新资源开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。
[0003]近些年来，科研工作者已经找到了多株对坎利酮具有转化能力的菌株，如赭曲霉(Aspergillus ochraceus )、根霉(Rhizopus n i gr i cans )、赤霉菌(Gi bbere 1 laintermedia)等。
[0004]其均能高效转化坎利酮为lla-ΟΗ-坎利酮，而关于其11α，15α双羟化的报道十分鲜见。可见lla，15a-di0H-坎利酮的合成，为留体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体;而且C1 Ια，15α双羟化反应作为一种新的留体羟化反应类型，为留体药物合成开辟了新的途径，具有一定的研究价值和市场意义。赤霉菌具有广域的底物谱，可用于转化多种甾体类化合物。本发明所涉及的利用赤霉菌转化坎利酮为11a，15a-di0H-坎利酮的方法还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种新型的坎利酮双羟基化产物(11a，15a-di0H-坎利酮)以及其转化合成方法。通过两步转化法，利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_1转化底物坎利酮为11α，15a-di0H_坎利酮。该菌株为赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4903，保藏日期为2011年5月24日，分类命名为Gibberella intermedia。
[0006]采用上述微生物转化坎利酮为lla，15a-di0H-坎利酮的方法，其具体步骤如下:
[0007](1)以赤霉菌CA3-1为生产菌株，25?35°C，150?220r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上；
[0008](2)制备CA3-1菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(1)的PDA固体培养基上的CA3-1菌株一环，接种于已灭菌的装有50?100mL种子培养基的500mL锥形瓶中，培养温度为25?35°C，置摇床上以180?220r/min的转速培养12?20h至对数生长中后期，即得到CA3-1菌株的种子培养液；
[0009](3)发酵培养:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以4%?8% (v/v)的接种量接种于发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装25?50mL发酵培养基，相同条件下培养20?24h，得发酵液；
[0010](4)生物转化:准确称取适量的底物坎利酮，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使其终浓度为4?8g/L，在转化温度28°C，200?220r/min的转速下转化48?60h，即得转化液；
[0011 ] (5)产物检测:将步骤(4)的转化液在8000?12000r/min下离心5?lOmin，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，菌体用适量乙醇抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙睛复溶晶体并通过0.22μπι的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析坎利酮、11α，15a-d1H_坎利酮的含量；
[0012]其中步骤(1)中所述的PDA培养基的成分及配比为:土豆200?500g/L;葡萄糖20?50g/L;酵母粉2?10g/L;琼脂粉10?20g/L;pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min;步骤
(2)中所述的种子培养基的成分及配比为:葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;NaCl 0.5?2g/L;KH2P04l?5g/L;调pH至7.0，121°C高压蒸汽灭菌15?20min;步骤(3)中所述的发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;玉米楽1?5g/L;pH自然，121°C高压蒸汽灭菌15?20min。
[0013]本发明所述的利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l转化坎利酮为1 Ια，15α-d1H-坎利酮为首次提出。
【附图说明】
[0014]图1为赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_1在发酵培养基中转化坎利酬(4g/L)为11 α，15α -d i 0H-坎利酮的过程研究。
【具体实施方式】
[0015]实施例1赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l转化坎利酮
[0016](1)制备赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株的种子液
[0017]挑取固体]培养基上的赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株一环，接种在装有lOOmL种子培养基的500mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200r/min的转速培养20?24h至对数期，即制得CA3-1的种子液；
[0018](2)将种子培养液以4%的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，以相同条件继续培养20小时，得到菌体发酵液；
[0019](3)将坎利酮投入到菌体发酵液中，投料浓度为4.0g/L，相同条件下转化60小时，提取产物进行HPLC分析，计算得到坎利酮转化率为90.1 %，1 la，15a-di0H-坎利酮的得率为58.5%。
[0020]实施例2
[0021](1)种子培养以及发酵培养同实施例1。
[0022](2)将坎利酮投入到菌体发酵液中，投料浓度为6.0g/L，相同条件下转化60小时，提取产物进行HPLC分析，计算得到坎利酮转化率为76.1 %，1 la，15a-di0H-坎利酮的得率为41.3%0
[0023]实施例3
[0024](1)种子培养以及发酵培养同实施例1。
[0025](2)将坎利酮投入到菌体发酵液中，投料浓度为8.0g/L，相同条件下转化60小时，提取产物进行HPLC分析，计算得到坎利酮转化率为54.3 %，1 la，15a-di0H-坎利酮的得率为34.7%。
[0026]实施例3赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株转化沃氏氧化物
[0027]精确称取适量沃氏氧化物，投入赤霉菌CA3-1菌株的静息细胞，使沃氏氧化物浓度为4?8g/L，在转化温度28°C，200?220r/min的转速下转化48?72h。
【主权项】
1.一株转化坎利酮生成11α，15a-d1H-坎利酮的菌株，该菌株为赤霉菌(Gibberellaintermedia)CA3-l，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4903，保藏日期为2011年5月24日，分类命名为Gibberella intermedia。2.利用赤霉菌CGMCCN0.4903转化沃氏氧化物为1 Ια，15a-d1H_沃氏氧化物的方法，其特征为:(1)将赤霉菌作为生产菌种从PDA平板上接入到种子培养基中，25?35°C，150?220r/min条件下培养12?20h，得到种子液;种子培养基的成分及配比为葡萄糖10?30g/L;酉孝母粉5?15g/L; NaCl 0.5?2g/L;KH2P04l?5g/L;调pH至7.0，121°C高压蒸汽灭菌15?20min; (2)将种子液以体积百分比4%?8%的接种量接种于发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装25?50mL发酵培养基，培养温度25?35°C，在150?220r/min转速下培养20?24h，得发酵液;发酵培养基的成分及配比为葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;玉米浆1?5g/L;pH自然，121°C高压蒸汽灭菌15?20min;(3)称取一定量的沃氏氧化物加入到菌体发酵液中，转化48?72h，即得转化液。
【专利摘要】本发明属生物技术领域，具体涉及利用赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1转化底物坎利酮为11α,15α-diOH-坎利酮的方法。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.4903。赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1能转化坎利酮为11α,15α-diOH-坎利酮，在底物投料浓度为4g/L时，坎利酮转化率高达90.1％，11α,15α-diOH-坎利酮的得率为58.5％。11α,15α-diOH-坎利酮的合成为甾体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体，具有一定的研究价值和市场意义。CGMCC No.490320110524
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/645, C12P33/06
【公开号】CN105483029
【申请号】CN201610017983
【发明人】许正宏, 李会, 史劲松, 孙锦
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月12日