一种发酵生产杆菌肽的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产杆菌肽的方法。
【背景技术】
[0002] 杆菌肽是一种由12种氨基酸组成的噻唑肽类窄谱抗生素，主要由特雷斯氏枯草杆 菌和地衣芽孢杆菌发酵产生，对革兰氏阳性球菌和杆菌有效，对少数革兰氏阴性菌、螺旋体 及放线菌也有一定的抑制作用。杆菌肽具有高效、低毒、残留量少等优点。因此，杆菌肽不仅 是一种重要的抗生素药物，也是安全性良好的畜禽抗生素饲料添加剂。
[0003] 杆菌肽是几种相似多肽组分的混合物，含有杆菌肽4、8132、83、(：1、02、034、？等 化学结构类似的异构体，其主要活性成分为杆菌肽A，分子式为C 66H1Q3N17016S。杆菌肽F是杆 菌肽A的降解产物，有肾毒性，需严格控制其含量。
[0004] 杆菌肽是类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，有吸湿性，易被氧化剂破坏，在溶液 中能被多种重金属盐类沉淀，杆菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚 中不溶。
[0005] 杆菌肽是肽类抗生素，由一系列氨基酸通过酶催化合成，因而氮代谢对杆菌肽的 合成影响明显。而目前的有机氮源大多为大宗农副产品，其质量受产地、加工方式等影响， 造成不同发酵批次间菌种的次级代谢水平不一致，进而影响下游纯化，最终影响产品质量。
[0006] 酵母粉和棉籽蛋白粉，是近年发展起来的有机氮源。其中棉籽蛋白粉是一种以特 定地区的优质棉籽为原料，采用先进的技术生产的高蛋白、低酚、低纤维、微生物利用效果 好的有机氮源，产品的蛋白含量在50%以上，氨基酸组成占总氮的90%以上，游离棉酚的含量 控制在600ppm以下，产品质量稳定。酵母粉为标准化有机氮源，蛋白质含量高（蛋白质占干 菌体总重50%以上），含有18种氨基酸，种类齐全，维生素和矿物质等含量丰富。但未见有报 道将两种有机氮源配合应用于地衣芽孢杆菌生物合成杆菌肽。
[0007] 杆菌肽为微生物发酵的次级代谢产物，存在于发酵液中，杆菌肽不仅对其他生物 有杀死或抑制作用，对产生菌自身也有杀死或抑制作用。随着杆菌肽在发酵液中浓度不断 增高，其产生菌受到高浓度产物的反馈调节作用，使产生菌生物细胞及酶的潜力不能充分 发挥，造成杆菌肽的产率难以提高，从而成为制约提高杆菌肽发酵水平的瓶颈。选育能耐受 高浓度杆菌肽的产生菌固然可以使生产指标得以提高，但并不能从根本上解决问题。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵制备杆菌肽存在的发酵过程不稳定 及发酵水平低的问题，提供一种通过优化发酵培养基配方、发酵条件来提高杆菌肽产量的 方法。
[0009] 本发明所提供的一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤： a、制备地衣芽孢杆菌菌株的种子液 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28-30°C、200-240 rpm，培养 20-28 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵 母粉10.0-20.0克、硫酸铵1.0-2.0克、氯化钠1.0-2.0克、七水硫酸镁1.0-1.5克，加水定容 至 100〇11^，？册.5-7.0，121°(3灭菌3〇11^11。
[0010] 本发明所述杆菌肽产生菌可选用菌株ATCC 10716。
[0011] b、制备地衣芽孢杆菌菌株的发酵液 将上述种子液以体积百分比6-10%的接种量接种于发酵培养基，在摇瓶或发酵罐中发 酵，发酵时间72-96 h，发酵温度28 -30 °C，得到发酵液； 其中所述发酵培养基按以下方法制得:玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉 籽蛋白粉15.0-30.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸铵2.0-3.0克、玉米浆3.0-5.0克、磷酸二 氢钾1.0-1.5克、氯化钠2.0-3.0克、七水硫酸镁1.0-2.0克，加水定容至1 OOOmL，pH6.5-7.0， 121°C 灭菌 30min。
[0012] 本发明的进一步改进在于:其中有机氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉添加比例为3:2。
[0013] 本发明的进一步改进在于:其中步骤b中发酵15-25小时之间添加经过灭菌后的超 顺磁性微球，继续发酵，总发酵时间72-96 h。
[0014] 本发明的进一步改进在于：发酵罐压力为0.05 ±0.0 IMpa、搅拌速度为300-400rpm，通气比为1:0 · 8-1 · 2vvm。
[0015] 本发明的进一步改进在于:所述超顺磁性微球的粒径为10_30um，粒径分布为单分 散，表面的功能基团为羧基基团;所述超顺磁性微球为经过盐酸处理后的酸式结构。
[0016] 本发明的进一步改进在于:超顺磁性微球的添加量为1.0-2.0%(w/v)，即每升发酵 液添加10-20g。
[0017] 由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是： 采用地衣芽孢杆菌菌株为出发菌株，在微生物发酵生产杆菌肽过程中，优化初始pH值、 发酵温度及时间、接种量等条件，优化复合有机氮源及添加比例，以稳定不同发酵批次间菌 种的次级代谢水平，降低杂质，在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，以减少反馈抑制，提 高杆菌肽的产量。
[0018] 本发明的有益效果： 上述优选条件，所获得杆菌肽的产量从550 U/ml提高到1228U/ml，为杆菌肽的工业化 生产提供了一种方法。本发明中通过优化配方和发酵条件，提高了杆菌肽产量，杂质F的含 量控制在2%以下，保证了批次间发酵单位的稳定性。添加超顺磁性微球后可吸附发酵液中 的杆菌肽，降低了发酵产物对产生菌的反馈抑制。综合优化后可使杆菌肽产量提高123%;提 高了产能，降低了能耗及废弃物的排放。
【附图说明】
[0019 ]图1为菌株发酵培养15小时的菌体形态。
[0020] 图2为菌株发酵培养25小时的菌体形态。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为工业级原料;所用的超顺磁性微球由苏州 纳微生物科技有限公司提供，所用的棉籽蛋白粉购自青岛科瑞，酵母粉购自安琪酵母股份 有限公司。
[0022]实施例1、500mL摇瓶发酵制备杆菌肽 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28°C、240 rpm、培养24 h获得 种子液。
[0023]其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉 20.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.5,121 °C 灭菌 30min。
[0024]本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0025]发酵培养基组成： 玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸铵3.0克、玉 米浆5.0克、磷酸二氢钾1.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL， pH6 · 5，121°C 灭菌 30min。
[0026] 摇瓶发酵培养:500 ml装量三角瓶6个，每瓶装50ml培养基，种子培养24小时后接 种，接种量为10%，温度28 °C、转速220 rpm，发酵培养72 h。
[0027] 发酵结束后，杆菌肽的发酵单位为651U/ml，结果见表1。
[0028]实施例2、5L罐发酵制备杆菌肽 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，30°C、200rpm、培养20h获得种 子液。
[0029] 其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉 10.0克、硫酸铵2.0克、氯化钠2.0克、七水硫酸镁1.5克，加自来水定容至1000mL，pH7.0,121 °C 灭菌 30min。
[0030] 本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0031 ]发酵培养基组成： 玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸铵6.0克、玉 米浆12.0克、磷酸二氢钾4.5克、氯化钠7.5克、七水硫酸镁6.0克，加自来水定容至3L， pH6.8，121°C灭菌30min，5L自动发酵罐发酵培养。
[0032]发酵条件:装料量3L，种子培养20小时后接种，接种量为6%，罐温29 °C、罐压0.05 ±0.01 Mpa、通气比 1:1.2 vvm，400 rpm搅拌，发酵96 h〇
[0033] 发酵结束后，经检测杆菌肽的发酵单位为752U/ml，结果见表1。
[0034] 实施例3、10L罐发酵制备杆菌肽 地衣芽孢杆菌菌株种子液的制备 将地衣芽孢杆菌菌株的斜面培养物接种于种子培养基，28°C、220 rpm、培养28 h获得 种子液。
[0035]其中所述的种子培养基按以下方法制得:玉米淀粉4.0克、葡萄糖15.0克、酵母粉 15.0克、硫酸铵1.0克、氯化钠1.0克、七水硫酸镁1.0克，加自来水定容至1000mL，pH6.8,121 °C 灭菌 30min。
[0036] 本发明所述杆菌肽产生菌为编号ATCC 10716的菌株。
[0037]发酵培养基组成： 玉米淀粉200.0克、葡萄糖50.0克、棉籽蛋白粉150.0克、酵母粉100.0克、硫酸铵10.0 克、玉米浆15.0克、磷酸二氢钾5.0克、氯化钠15.0克、七水硫酸镁5.0克，加自来水定容至 5L，pH7.0，121°C灭菌30min，10L自动发酵罐发酵培养。
[0038] 发酵条件:装料量5L，种子培养28小时后接种，接种量为8%，罐温30 °C、罐压0.0