一株生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的重组菌株及其构建与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株及其构建与应用，具体涉及一株用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002]反式-4-羟基-L-脯氨酸，简称L-羟基脯氨酸或羟脯氨酸，主要存在于动物的胶原蛋白中，含量可达10%左右，其作用是加强结缔组织的弹性和韧性。在食品添加剂领域，由于羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料风味，而且还具有皮肤修复功能，常作为饮料添加剂。在化妆品添加剂领域，由于羟脯氨酸具有抗氧化、抗辐射的作用，可消除氧化剂以及调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，以期保养皮肤和延缓衰老，是化妆品的重要添加剂。在医药领域，由于羟脯氨酸存在两个手性中心，易于衍生化，药理活性多样，用于合成新一代培南类抗生素，还应用于多种新创新制药物的合成，既可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等;又可加快伤口愈合以及治疗各种皮肤疾病。可见，羟脯氨酸广泛应用于食品添加剂、化妆品和药物中间体。
[0003]目前，羟脯氨酸的生产主要有三种路线:动物骨胶提取法、生物催化法和发酵法。其中，动物骨胶提取法是以动物骨胶为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程获得产品，是国内生产企业采用的主要方法。但该方法由于需要用到强酸强碱水解，并且骨胶中成分复杂，分离提取难度大，后续需要采用离子交换树脂进行分离，产生大量的废水。因此，在环保压力日益增大的今天，该方法渐渐面临被淘汰的命运。
[0004]生物催化法是以L-脯氨酸和α_酮戊二酸为原料，利用高表达L-脯氨酸羟化酶的大肠杆菌作为酶源，经酶催化得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。如现有技术CN94115662.1中公开了一种反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法，该发明采用胞囊菌的羟基化酶，在维生素C，酮戊二酸，硫酸亚铁的条件下，催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。CN96190335.X中公开了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，该发明利用胞囊菌羟基化酶基因构建表达质粒，导入大肠杆菌，构建工程菌。在发酵表达酶的同时加入葡萄糖和L-脯氨酸，发酵72h，累积产物24g/L<XN201210203625.9中公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产L_4_羟脯氨酸的方法，该发明通过构建羟基化酶质粒，导入大肠杆菌得到产L-4-羟脯氨酸的重组菌，然后在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，24h后产生0.3g/L羟基脯氨酸。CN201310283918.7中公开了一种反式-4-羟脯氨酸的生产方法，该发明向羟基化酶大肠杆菌工程菌中导入透明颤菌血红蛋白基因，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，48h后产生4.93g/L羟基脯氨酸。CN201410029052.1和CN201310235337.6中利用截断优化的羟基化基因构建了过程菌，发酵表达酶，再利用菌体转化，转化时添加酮戊二酸、MES缓冲液、L-脯氨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸等，使转化率达97%以上，经72h反应，产物达26g/L。由此可见上述现有技术中利用生物催化法需要额外添加底物L-脯氨酸，有的还要添加α-酮戊二酸，这两种原料的成本较高且转化率低，使得最终体系中残留L-脯氨酸而存在难于纯化的问题，因此生产成本居高不下。
[0005]发酵法相对于生物催化法和骨胶提取法而言，整体工艺相对简单且易操作，同时采用廉价的葡萄糖为原料，成本低。目前，现有发酵法生产羟脯氨酸菌株在构建时，通常将需要加强表达的三个基因克隆在质粒表达载体上，然后引入大肠杆菌中表达；同时在摇瓶发酵或5?10L的实验室发酵罐发酵时，通过加入合适的抗生素，一方面防止感染其他杂菌，另一方面可以给大肠杆菌一个选择压力，使得大肠杆菌在不断的传代复制过程中，必须含有抗性质粒的细胞才能生长，从而避免了质粒的丢失。但在大规模的工业发酵时，一般不可能在培养基中添加抗生素，不仅因为控制成本的考虑，还因为添加了大量抗生素的发酵液不能被排放到环境中，以免对环境生态造成太大的干扰。因此，大规模发酵时，由于发酵规模大，周期长，菌种传代次数多，质粒在多次传代复制过程中会不断的发生丢失，而被质粒承载的表达基因也随之丢失。这就意味着在发酵的后期，发酵罐中不断增殖的细菌中包含了很大一部分无效的细菌，而且越往后期，无效细菌占得比例就越大。表现出来就是越往发酵后期，羟脯氨酸的产量增加速度逐渐变慢，直至不再增加。例如现有技术CN97117929.8中公开了一种反式一 4 一羟基一 L 一脯氨酸的制造方法，该发明强化宿主菌大肠杆菌L-脯氨酸生物合成系统，并敲除了脯氨酸分解酶系，利用胞囊菌羟基化酶基因构建表达质粒，导入改造的大肠杆菌，构建工程菌。在发酵时流加葡萄糖，生产羟基脯氨酸，最终发酵液中羟脯氨酸浓度可达25g/L左右。该发明工艺生产简单，成本优势明显。但该发明工艺在实际生产中也存在以下问题，一是表达基因通过质粒表达载体引入，在大规模长周期工业发酵中，质粒容易丢失，导致生产菌种遗传稳定性差，发酵后期产量下降的问题。二是通过强化表达了耐受L-脯氨酸反馈抑制的L-谷氨酸激酶突变体基因proB74和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA，虽然增加了细胞内L-脯氨酸的代谢通量，最终增加了羟脯氨酸的产量。但此处的构建也导致了细胞内L-脯氨酸的浓度始终较高，直至发酵结束时，发酵液中L-脯氨酸浓度较高，约为羟脯氨酸浓度的三分之一;再加之L-脯氨酸和羟脯氨酸二者物理性质比较相近，难以通过简单的结晶方法分离提纯，只能通过离子交换树脂加以分离纯化;而离子交换树脂的使用不仅增加了生产周期，而且加大了酸碱用量，更严重的时产生了大量的酸碱废水，带来了严重的环境问题，大大增加了成本。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是，提供一株用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的具备遗传稳定性高，产量高，副产物少的重组菌株及其构建方法与应用。
[0007]本发明解决技术问题采用的技术方案是:
一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，经鉴定为大肠杆菌HJ(Escherichia coli HJ)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2015年9月17日，保藏编号为CCTCC NO: Μ 2015550。
[0008]作为优选，所述重组菌株是由L-脯氨酸羟化酶基因，野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酰磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到载体上，前端加上强启动子，然后设计包含了同源臂的长引物将表达框扩增出来，利用RED重组技术一次性将其整合到大肠杆菌基因组的L-脯氨酸脱氢酶基因位点得到的。
[0009]进一步，所述L-谷氨酸激酶基因和L-谷氨酰磷酸还原酶基因来源于大肠杆菌，分别由proB和proA基因编码，为大肠杆菌中从L-谷氨酸到L-脯氨酸的关键代谢酶，加强表达有助于增加代谢通量，提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。可通过PCR从大肠杆菌基因组DNA中扩增获得，或者通过基因合成获得。
[0010]进一步，所述L-脯氨酸羟化酶来源于胞囊菌，由proH基因编码，导入大肠杆菌后使得大肠杆菌具备了从葡萄糖直到反式-4-羟基-L-脯氨酸的代谢通路，该基因可通过基因合成获得。
[0011]进一步，L-脯氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌，由putA基因编码，催化L-脯氨酸降解为L-谷氨酸。将四个表达框整合到该位点会使得L-脯氨酸脱氢酶失活，避免了 L-脯氨酸降解为L-谷氨酸，形成无效循环通路，分流L-脯氨酸到羟脯氨酸的代谢流，有助于增加终产物反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
[0012]进一步，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因。
[0013]进一步，强启动子来源于枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因启动子。可实现基因的组成型高效表达，根据序列基因合成获得。
[0014]本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株的构建方法，通过将L-脯氨酸羟化酶基因，野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酰磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到载体上，前端加上强启动子，然后设计包含了同源臂的长引物将表达框扩增出来，利用RED重组技术一次性将其整合到大肠杆菌基因组的L-脯氨酸脱氢酶基因位点。
[0015]进一步，所述用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株的构建方法，包括以下步骤:
(1)L-脯氨酸羟化酶基因及其启动子的克隆:根据NCBI数据库中GenBank:D78338.1设计L-脯氨酸羟化酶基因proH序列，如SEQ ID NO: 1所示，和枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因启动子Pxyl序列，如SEQ ID N0:2所示，将二者拼接到一起，为便于后续克隆，两端分别加上EcoRI和ΚρηΙ位点，基因合成整个片段Pxyl+proH，SEQ ID NO: 3所示;然后利用基因克隆技术将Pxyl+proH片段克隆到pUC18载体的EcoRI和ΚρηΙ位点处，得到pUC18-pxyl-proH;
(2)L-谷氨酸激酶基因proB和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA基因的克隆:设计引物对，F