一株产果糖基转移酶的重组酿酒酵母及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株产果糖基转移酶的重组酿酒酵母及其制备方法与应用，属于基因工程和发酵工程领域。
【背景技术】
[0002]低聚果糖又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为:G-F-Fn，n=l?3(G为葡萄糖，F为果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖残基上通β-1-2糖苷键连接1?3个果糖基而形成的果糖寡聚体:蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。与传统糖类相比，新型低聚果糖可作为益生元，促进双歧杆菌的生长、减少有害菌。低聚果糖具有水溶性膳食纤维的功效，且无任何毒副作用。低聚果糖广泛存在于大麦、西红柿、黑麦等植物中，但其含量较少(〈1%)，开发较难。利用微生物低聚果糖生产酶(果糖基转移酶)可得到高纯度、高产量的低聚果糖，果糖基转移酶是一种具有果糖基转移活性的酶，能作用于蔗糖催化获得蔗果三糖等低聚糖。
[0003]在果糖转移酶研究方面，目前国内主要集中在野生菌筛选、性质测定等方面。王立梅等对一株曲霉果糖转移酶酶学性质及底物特异性进行研究，在pH 5.5，30°C条件下，果糖基转移酶具有最高活性。郑氏金云等研究了在不同蔗糖浓度下从黑曲霉AS0023纯化的转化酶(INV)和果糖转移酶(FTS)的酶催化活力。在将来的研究过程中，具有优良催化性能的优良果糖基转移酶基因的挖掘与发现显得尤为重要
[0004]近年来，以S.cerevisiae作为宿主菌表达异源蛋白日益引起重视。酿酒酵母表达宿主在具有诸多优点，如食品安全型宿主、基因操作简单、易培养、快速分裂等。因此，采用高效异源表达食品酶一一果糖基转移酶对于低聚果糖的生产及其他食品酶的大规模生产均具有重要意义。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株产果糖基转移酶的重组酿酒酵母及其制备方法与应用。
[0006]本发明所述的产果糖基转移酶的重组酿酒酵母菌株，其特征在于:该菌株命名为S.cerevisiae W303-pYX212_Nl，可异源表达果糖基转移酶。
[0007]上述的重组S.cerevisiae W303-pYX212_Nl，由如下方法制得:
[0008](1)酶编码基因的获得:通过RT-PCR方式，获得来源于A.niger的果糖基转移酶编码基因fru。
[0009](2)表达载体的构建:以质粒pYX212构建重组质粒，获得含有果糖基转移酶基因fru的重组质粒pYX212-fru。
[0010]( 3 )重组菌株的构建:将步骤(2 )中构建的重组质粒p YX 2 1 2 -f r u转化到
S.cerevisiae W303中，通过筛选得到转化成功的转化子。
[0011](4)发酵产酶验证:采用250mL摇瓶培养重组菌株，测定果糖基转移酶酶活力，获得高效表达重组菌株:S.cerevisiae W303-pYX212_Nl。
[0012]上述重组S.cerevisiae菌株构建方法中:步骤(1)所述果糖基转移酶基因fru来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，其已提交GenBank数据库，其GenBank Access1n N0.为KT724055。
[0013]上述重组S.cerevisiae构建方法中:步骤(2)所述质粒载体为pYX212。
[OOM] 上述重组S.cerevisiae构建方法中:步骤(3)所述转化方法优选醋酸锂转化法。
[0015]上述重组S.cerevisiae菌株构建方法中:步骤(3)所述筛选得到转化成功的转化子的方式优选为:用添加15-25g/L葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura筛选正确的转化子。
[0016]重组S.cerevisiae菌株发酵生产果糖基转移酶的方法是:重组菌S.cerevisiaeW303-pYX212-Nl在250mL摇瓶中进行培养，培养温度为25-35°C，发酵时间为30-60h。
[0017]上述表达果糖基转移酶的重组S.cerevisiae，即S.cerevisiae W303的菌学特征为:该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭球形，不运动，营养细胞为单倍体，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Ura)下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，成菌落存在，菌落表面湿润、光滑、呈乳白色。
[0018]果糖基转移酶制备:4°C条件下，5000-10000rmp离心5-20min，获得菌体细胞。用相同体积的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 55)洗涤菌体细胞3-6次。再加入等体积的缓冲液混匀后，采用超声破碎仪破碎细胞。4°C条件下，5000-10000rmp离心5-20min，获得含有果糖基转移酶的上清液。
[0019]果糖基转移酶酶活力测定:高效液相色谱(HPLC)法，具体参数如下:Chromaster高效液相色谱仪。色谱柱:XBridgeTM Amide 5μηι，4.6_X250mm。流动相:60-75%乙腈。流速:1.0-1.5mL/min。柱温:28_30°C。进样量:1 OyL。检测器:RI示差折光检测器。
[°02°]本发明所述的重组S.cerevisiae菌株的应用，主要体现在基于食品级表达宿主构建的重组菌S.cerevisiae W303-pYX212_Nl进行发酵生产果糖基转移酶。
[0021]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附图说明】
[0022]图1:重组质粒pYX212_fru的构建图谱
[0023]图2:果糖基转移酶高表达重组S.cerevisiae菌株转化子筛选
[0024]图3:S.cerevisiaeW303-pYX212_Nl发酵产酶曲线
【具体实施方式】
[0025]实施例1:构建重组载体pYX212_fru
[0026]通过RT-PCR方法与PCR方法，获得果糖基转移酶编码基因。用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切消化并纯化后的fru基因和穿梭载体pYX212，用T4DNA连接酶于16°C连接，连接产物转化宿主菌大肠杆菌JM109，转化菌液涂布在氨苄青霉素浓度为lOOmg/1的LB平板。37°C过夜培养，挑选阳性克隆子用酶切和PCR方法鉴定，并进行测序验证。最终获得含有正确f ru基因的酵母表达质粒pYX212-f ru。
[0027]实施例2:重组载体pYX212_fru转化酿酒酵母
[0028]将重组质粒pYX212-f ru通过化转转入S.cerevisiae感受态细胞，由于质粒pYX212中带有Ura3基因，与尿嘧啶缺陷型菌株遗传互补，得到能在MM平板正常生长的基因工程菌。酿酒酵母化转的方法:1 )W303单菌落接入50mL YH)培养基，30°C培养至0D= 1.0。2 )TE溶液清洗，重悬在lmL 100mM LiCl中。3)30°C 200rpm培养比。4) 10yL DNA样品，88yL细胞，2yL鲑鱼精混匀，30°C培养3011^11。5)加入900yL PEG3350溶液，30°C 200rpm培养比。6)42°(3热激5min，快速冷却至室温。7)离心水洗，涂布MM平板，筛选阳性克隆。
[0029]实施例3:S.cerevisiaeW303-pYX212_Nl发酵产酶
[0030]将筛选获得阳性克隆，接种至250mL摇瓶中进行发酵产酶，筛选可高效表达重组果糖基转移酶S.cere vis iae菌株。如图2所不，其中S.cerevisiae W303-pYX212_Nl的产酶量最高，为39.79U/mL。将重组菌S.cerevisiae W303-pYX212_Nl接种至250mL摇瓶中，在30°C条件下发酵168h，取样测定果糖基转移酶酶活力(图3)。随着发酵的进行，当发酵至144h，重组菌S.cerevisiae W303_pYX212_Nl的菌浓(ODsqq)达到最大，为20.64。4°(3条件下，1 OOOOrmp离心lOmin，获得菌体细胞。用相同体积的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 5.5)洗涤菌体细胞3次。再加入等体积的缓冲液混匀后，采用超声破碎仪破碎细胞。4°C条件下，lOOOOrmp离心lOmin，获得含有果糖基转移酶的上清液。随着发酵的进行，当发酵至144h，重组菌
S.cerevisiae W303-pYX212_Nl的果糖基转移酶酶活力达到最大，为39.79U/mL。
【主权项】
1.一株产重组果糖基转移酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，其特征在于:该菌株命名为S.cerevisiae W303-pYX212_Nl，可异源表达果糖基转移酶。2.酶编码基因的获得:通过RT-PCR方式，获得来源于A.niger的果糖基转移酶编码基因fruo3.表达载体的构建:以质粒pYX212构建重组质粒，获得含果糖基转移酶基因fru的重组质粒pYX212-fru。4.重组菌株构建:将步骤(2)中建立的重组质粒pYX212-fru转化到S.cerevisiaeW303中，通过筛选得到转化成功的转化子。5.发酵产酶验证:采用250mL摇瓶培养重组菌株，测定果糖基转移酶酶活力，获得高效表达重组菌株:S.cerevisiae W303-pYX212_Nl。6.权利要求1所述的表达重组果糖基转移酶的S.cerevisiae菌株在发酵生产果糖基转移酶中的应用。7.所述重组S.cerevisiae菌株发酵生产果糖基转移酶的方法是:重组菌S.cerevisiaeW303-pYX212-Nl在250mL摇瓶中进行培养，培养温度为25-35°C，发酵时间为30-60h。8.果糖基转移酶获得的方法是:4°C条件下，5000-10000rmp离心5-20min，获得菌体细胞。用相同体积的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 5.5)洗涤菌体细胞3-6次。再加入等体积的缓冲液混匀后，采用超声破碎仪破碎细胞。4°C条件下，5000-10000rmp离心5-20min，获得含有果糖基转移酶的上清液。
【专利摘要】本发明公开了一株表达果糖基转移酶的重组酿酒酵母菌株及构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将黑曲霉(Aspergillus？niger)来源的果糖基转移酶基因(fru)克隆连接到酿酒酵母(Saccharomyces？cerevisiae)表达载体pYX212，并转化S.cerevisiae？W303宿主。经筛选鉴定得到一株高产果糖基转移酶的重组菌株，命名为：S.cerevisiae？W303-pYX212-N1。在250mL摇瓶中，重组S.cerevisiae菌株表达的果糖基转移酶酶活力可达(39.79U/mL)。这为果糖基转移酶的高效表达与其在工业中应用具有重要意义与巨大的应用价值。
【IPC分类】C12N15/81, C12R1/865, C12N1/21
【公开号】CN105483070
【申请号】CN201510993097
【发明人】杨海泉, 郭文文, 刘晗, 许菲, 陈献忠, 沈微, 樊游
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月24日