一种大鼠胚胎干细胞高效培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培养基，尤其是涉及一种大鼠胚胎干细胞高效培养基。
【背景技术】
[0002] 大鼠胚胎干细胞具有极其重要的科研价值。而大鼠胚胎干细胞的培养方法由 Austin Smith与应其龙等于2008年所发明。最早的大鼠胚胎干细胞培养基主要依靠 "3i"抑 制剂体系：CHIR99021，PD184352和SU5402。随后，随着研究的深入，应其龙又将"3i"大鼠胚 胎干细胞培养体系优化为"2i"培养体系:CHIR99021PD0325901。但是"2i"培养体系培养时 间较长，并且不容易获得大型克隆，同时其稳定性较差。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种效果稳定、培养 周期短、可获得大型克隆的大鼠胚胎干细胞高效培养基。
[0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0005] -种大鼠胚胎干细胞高效培养基，每40ml的大鼠胚胎干细胞高效培养基包括以下 成分： DMEM/F12 培？'MG 20ml Neurobasal 培养基 2〇ml.， b-疏丨乙0? 1,65χ ΙΟ 8moK CHIR99021 1.2χ!0 7mo 1，
[0006] PD0325901 4>· i O'Vol, Ν-2添加剂 （) 2mh B-27 添加剂 0,4 ml， L-谷氨酰胺 2xlO'Viol，
[0007] 重组小鼠白血病抑制因子 4.14ul。
[0008] 所述的b -巯基乙醇是以D P B S为溶剂的溶液形态，且b -巯基乙醇溶液的浓度为 55mM〇
[0009] 所述的CHIR99021是以DMS0为溶剂的溶液形态，且CHIR99021溶液的浓度为10mM。
[0010] 所述的Η)0325901是以DMS0为溶剂的溶液形态，且Η)0325901溶液的浓度为10mM。
[0011] 所述的N-2添加剂为100倍浓度储存液。
[0012]所述的B-27添加剂为无血清的50倍浓度储存液。
[0013 ]所述的重组小鼠白血病抑制因子为1 〇7单位。
[0014]作为优选，每40ml的大鼠胚胎干细胞高效培养基还包括以下成分:青链霉素双抗 溶液0.5ml，所述的青链霉素双抗溶液含5000单位青霉素和5000ug链霉素。青链霉素双抗溶 液为防止细胞污染而加入，其本身对大鼠胚胎干细胞高效培养无显著作用，可根据实际情 况决定是否添加。
[0015] 重组小鼠白血病抑制因子，即recombinant mouse Leukemia Inhibitory Factor (简称为mLIF，本培养基所使用重组小鼠白血病抑制因子为107单位）。
[0016] 培养基成分主要作用：
[0017] DMEM/F12培养基:此培养基可用来培养啮齿类动物细胞，尤其适合对大鼠和兔子 细胞的培养，并被证明在骨髓瘤与杂交瘤细胞培养中可以使细胞处于高质量状态。
[0018] N-2添加剂：主要用于成神经细胞瘤以及周围神经系统（PNS)与中枢神经系统 (CNS)的原代细胞培养。N-2添加剂可以替代Bottenstein中的N1添加剂，用于添加了生长因 子bFGF和EGF的Neurobasal培养基或DMEM培养基。
[0019] Neurobasal培养基：用于培养出生前和胎儿神经元细胞。使用时需添加 B-27添加 剂。此培养基可用于海马神经元，大脑皮层和大脑其他区域的神经细胞的生长。此外，该培 养基可以在不添加胶质细胞饲养层的情况下维持神经细胞的同源群落存活。
[0020] B-27添加剂:是无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元 的生长。该培养基可以与Neurobasal培养基组合使用，在神经细胞培养时省略了饲养层细 胞。
[0021] L-谷氨酰胺:主要用于细胞培养，可以作为原料合成嘌呤、嘧啶核苷酸，氨基糖，谷 胱甘肽以及谷氨酸，对于细胞生长非常重要。
[0022] b_巯基乙醇:可以促使胚胎干细胞分裂，提高获取囊胚的质量。
[0023] CHIR99021:CHIR99021可以抑制GSK-3,使胞内游离β-catenin增加，激活经典Wnt ?目号通路。
[0024] TO0325901:是非ΑΤΡ竞争性的ΜΑΡΚ激酶ΜΕΚ抑制剂。苏氨酸/酪氨酸激酶ΜΕΚ是RAS/ RAF/MEK/ERK信号通路的关键组成部分，在胚胎干细胞增殖分化过程中具有重要作用。 PD0325901可精确有效地抑制ΜΕΚ。
[0025]重组小鼠白血病抑制因子:可以维持胚胎干细胞干性状态。
[0026] 在配制培养基时首先将20ml DMEM/F12培养基与0.2ml Ν-2添加剂（100倍浓度储 存液)配成混合液1。
[0027] 将20ml Neurobasal培养基与0.4ml B-27添加剂(无血清，50倍浓度储存液）以及 L-谷氨酰胺4 X l(T5m〇l混匀制成混合液2 〇
[0028] 将20ml混合液1与20ml混合液2混匀后再加入1 · 65 X 10-8mol b-巯基乙醇，1 · 2 X 10-7mo 1 CHIR99021，4X10-8mol PD0325901。
[0029] 本发明培养基的使用方法:生长在饲养层细胞上的大鼠胚胎干细胞可直接添加此 培养基进行培养。添加量为2_3ml/孔（以6孔板为例），大约培养2-3天，根据细胞生长状态进 行传代或冻存。另外，本发明产品也可替代传统2i培养基用于原代大鼠胚胎干细胞分离培 养。
[0030] 本发明制备的高效培养基可用于大量培养和扩增大鼠胚胎干细胞，为制备基于胚 胎干细胞基因修饰大鼠疾病模型、研究大鼠干细胞的自我更新和定向分化的分子机制以及 建立相关分化细胞模型提供了前提条件和基础。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0032] 1、本发明对"2i"大鼠胚胎干细胞培养体系进行优化，与传统"2i"培养基相比将抑 制剂ro〇325901、CHIR99021的使用量提升了一倍，并加入了重组小鼠白血病抑制因子，降低 了传统"2i"培养基中的β-巯基乙醇浓度。使用传统"2i"培养基需要4-5天才可使大鼠胚胎 干细胞长到合适大小及密度，而使用本发明培养基需要2-3天即可长到相同密度，且单个干 细胞克隆要大于使用传统"2i"培养基所培养的大鼠胚胎干细胞。
[0033] 2、使用本发明的培养基可获得大型克隆：用该发明高效培养基可培养出平均直径