一种dc细胞培养方法及培养基的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种DC细胞培养方法及培养基。
【背景技术】
[0002] DC细胞是一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细 胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞 (dendritic cells，DCs)。它是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。未成熟DC细胞具有较强的迀移能力，成 熟DC细胞能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。在已知的 APC中，DC细胞的抗原提呈功能最强，大部分的杀伤性T细胞都需要靠 DC细胞去识别抗原，并 加工处理后呈递上去。
[0003] 成熟的DC细胞可用于治疗癌症以及其他疾病。但是DC细胞难于扩增，数量不足成 为应用的一大限制。如何获得足够数量的DC细胞是现在研究领域的热门。现有技术最好的 方案是采用life公司的AMV培养基添加50ng/ml IL-4(白细胞介素-4)和50ng/ml GM-CSF (粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子)培养获得DC细胞。但该种方法获得的DC细胞并不理想， DC细胞几乎不扩增。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种提高DC细胞扩增倍数的DC细胞培养 方法和培养基。
[0005] 一种DC细胞培养基，含有基础培养基、重组人胰岛素、GM-CSF、IL-4、IL-15(白细胞 介素 -15)、黄体酮、重组人转铁蛋白和人血白蛋白。
[0006] 优选地，基础培养基为DMEM培养基。
[0007] 优选地，所述DC细胞培养基各组分含量如下： DMEM 培养基 80-90v/v%, 重组人转铁蛋白 10-25pg/ml， GM-CSF 35-70ng/ml, IL-4 10-50ng./ml，
[0008] IL-15 10-40ng/ml, 黄体麵 0.5-3mg/ml, 重组人胰岛素 l-4mg/ml， 人血白蛋白 .30-80mg/ml， 余量为无菌注射用水。
[0009] 优选地，所述DC细胞培养基各组分含量如下： DMEM 培养基 86v/v%,. 重组人转铁蛋白 15gg/ml， GM-CSF 50ng/ml, IL-4 20ng/ml,
[0010] IL-15 20ng/ml, 黄体酮 _1.5mg/ml， 重组人胰岛素 2mg/mi， 人血.白蛋白 5:0mg/ml， 余量为无菌注射用水。
[0011] 一种DC细胞培养方法，使用本发明DC细胞培养基和包被有CD28单抗的培养容器培 养PBMCXD28单抗可以促进DC细胞的分化和增殖，而采用包被的方式不仅可以减少CD28的 用量，还可以使得细胞和CD28以及其他细胞因子的接触更加充分。
[0012]优选地，所述DC细胞的培养方法包括以下步骤：
[0013] S1、自10ml血液中提取PBMC，按照PBMC密度1 X 106cells/ml添加含有10%FBS的 DMEM/F12培养基将细胞混匀，然后将其加入到包被有⑶28单抗的培养瓶中，在37°C、5%C02 条件中培养3小时；
[0014] S2、弃去未贴壁细胞，用roS冲洗一次，然后加入10ml本发明DC细胞培养基;两天后 加入10ml本发明DC细胞培养基;之后每隔2-3天换液一次；
[0015] S3、培养到第10天时加入50ng/ml TNF-α刺激DC细胞成熟，第13天时收集成熟DC细 胞。
[0016] 优选地，⑶28单抗包被培养瓶的方法为：用含有0. lμg/mlCD28单抗的PBS包被培养 瓶1小时，弃去包被液，用PBS清洗2遍。
[0017] 优选地，所述血液为外周血或脐血。
[0018] 优选地，步骤S2中每次换液体积不超过30ml。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0020] (1)本发明DC细胞培养方法和培养基显著提高了DC细胞的增殖倍数，使用本发明 DC细胞培养方法和培养基所得的DC细胞数量为104.1-112.5百万个，是对比例1-3所得DC细 胞数的30倍左右。
[0021] (2)本发明DC细胞培养方法和培养基极大提高了培养出的DC细胞的纯度。使用本 发明DC细胞培养方法和培养基获得细胞中CD86+CDllc+细胞的含量明显高于对比例1-3获得 细胞的⑶86+CD1 lc+细胞含量，约为对比例1-3获得细胞中⑶86+⑶1 lc+细胞含量的2倍。
[0022] (3)本发明DC细胞培养基中DMEM培养基为细胞提供基本营养成分，GM-CSF、IL-4和 IL-15刺激细胞向DC细胞分化、生长，黄体酮促进细胞增殖，重组人胰岛素促进细胞对葡萄 糖的代谢，重组人转铁蛋白转运细胞代谢废物;人血白蛋白可以减少细胞损伤，围成细胞渗 透压，保护细胞。本发明DC细胞培养方法采用CD28包被的培养容器培养PBMC，不仅可以减少 CD28的用量，还可以使得细胞和CD28以及其他细胞因子的接触更加充分。
【附图说明】
[0023]图1为本发明效果实施例1的细胞数量结果图。
[0024] 图2为本发明效果实施例1的细胞活率结果图。
[0025] 图3为本发明效果实施例2的⑶86+⑶llc+细胞的含量图。
【具体实施方式】
[0026] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。 [0027] 实施例1
[0028] 一种DC细胞培养基，含有下述含量的下述组分:DMEM培养基(GIBC0)86v/v%，重组 人转铁蛋白（Sigma) 15μg/ml，GM-CSF(peprotech)50ng/ml，IL-4(peprotech)20ng/ml，IL-15(口6口1'〇丨6。11)2〇1^/1111，黄体酮（大连美仑生物）1.511^/1111，重组人胰岛素（3丨81]^)211^/1111， 人血白蛋白（郑州莱士)50mg/ml，余量为无菌注射用水。
[0029]使用上述DC细胞培养基培养DC细胞的方法，包括以下步骤：
[0030] Sl、10ml外周血或脐血添加等体积的生理盐水稀释，添加稀释液三分之一倍体积 的Ficoll分离液，700g离心20-30min，升降速降为零，吸取中间白膜层；白膜层细胞用生理 盐水清洗两遍，得到PBMC，进行计数；
[0031]用含有0. lμg/mlCD28单抗的ros 4ml包被T75培养瓶1小时，弃去包被液，用PBS清 洗2遍得到⑶28单抗包被的T75培养瓶；向PBMC中加入含10%FBS的DMEM/F12培养基，使PBMC 的密度为1 X 106cells/ml，然后将其加入⑶28单抗包被的T75培养瓶中，在37°C、5%二氧化 碳的培养箱中培养3小时，使DC细胞贴壁；
[0032] S2、取出培养瓶，弃去未贴壁细胞，用PBS冲洗培养瓶一次，然后加入10ml本发明DC 细胞培养基;两天后换液，加入本发明DC细胞培养基10ml;之后每隔2-3天换液一次，每次换 液体积不超过30ml;
[0033] S3、培养到第10天时加入50ng/ml TNF-α刺激DC细胞成熟，第13天时收集成熟的DC 细胞。
[0034] 实施例2
[0035] 一种DC细胞培养基，含有下述含量的下述组分:DMEM培养基80v/v%，重组人转铁 蛋白 lOμg/ml，GM_CSF 35ng/ml，IL_410ng/ml，IL_1510ng/ml，黄体酬0 · 5mg/ml，重组人膜岛 素 lmg/ml，人血白蛋白30mg/ml，余量为无菌注射用水。
[0036]使用上述DC细胞培养基培养DC细胞的方法与实施例1相同。
[0037] 实施例3
[0038] 一种DC细胞培养基，含有下述含量的下述组分:DMEM培养基90v/v%，重组人转铁 蛋白 25μg/ml，GM_CSF 70ng/ml，IL_450ng/ml，IL_1540ng/ml，黄体酮3mg/ml，重组人胰岛素 4mg/ml，人血白蛋白80mg/ml，余量为无菌注射用水。
[0039]使用上述DC细胞培养基培养DC细胞的方法与实施例1相同。
[0040] 对比例1
[0041 ] 本对比例中使用的DC细胞培养基为含50ng/ml IL-4、50ng/ml GM-CSF的AM V培 养基。