一种中性内切木聚糖酶及其编码基因与应用

文档序号:9722637阅读:515来源:国知局
一种中性内切木聚糖酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域,特别涉及一种中性内切木聚糖酶及其编码基因与应 用。
【背景技术】
[0002] 半纤维素是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源。木聚糖是以木吡喃糖为单 位的由β_1,4键连接的半纤维素,富含于阔叶树和大多数一年生植物体内。而半纤维素在自 然界中含量占生物量的30%,仅次于纤维素。
[0003] 木聚糖是一种杂聚多糖,它的主链由吡喃木糖通过β-1,4糖苷键连接而成。通常所 说的木聚糖酶即内切,4-D_木聚糖酶(endo-β-Ι,4-D-xylanase)[EC3.2.1.8],它的主要 作用是随机地切割木聚糖主链骨架吡喃木糖残基之间的β-1,4-糖苷键,生成不同长度的木 糖、寡聚木糖或带有侧链的寡聚木糖。由于木聚糖酶在木聚糖降解过程中发挥了重要作用, 它是木聚糖降解酶系中最关键、最重要的酶,也是木聚糖降解相关酶中研究最多、最有应用 价值的一类酶。
[0004] 内切β-1,4_木聚糖酶属于糖苷水解酶,其结构具有丰富的多样性。根据木聚糖酶 催化结构域的氨基酸同源性和疏水簇分析,内切β-l,4木聚糖酶酶分布在糖苷水解酶第5, 7,8,10,11,30,43等六个家族。截至目前,糖苷水解酶家族已达到131个(http:// www. cazy .org),随着木聚糖酶研究的发展,将可能会有更多新的木聚糖酶不断被鉴定出 来。不同家族木聚糖酶的结构、作用方式、酶学性质及底物特异性都有很大区别。目前发现 的木聚糖酶基本都分布在第10和第11家族,其他家族的木聚糖酶数量极少。
[0005] 第10家族木聚糖酶一般具有较高分子量(大于30kD),低等电点(pi),常具有多结 构域。其结构是典型的(β/α)8桶状结构,整体结构呈现出主要由α-螺旋和β-折叠重复出现 而构成上面略大下面略小的形状。在相应的保守位置有相同的活性中心Glu,作催化反应的 亲核中心和酸/碱催化氨基酸,其催化机制为酸碱催化机制。第10家族木聚糖酶对短链的寡 聚木糖具有较高活性,揭示它们具有更小的底物结合位点。
[0006] 第11家族木聚糖酶的特点是低分子量(小于30kD),常常只具有一个以β-折叠为主 的结构域,具有较高等电点(ρ I)。其催化结构域为β - j e 11 y r ο 11结构,由两个β -折叠片和一 个螺旋形成,形似半握右拳状,这个结构域由两个β_折叠片层扭曲成近直角形状,形成一 个深且狭长的沟缝状结构。其催化机制为双交换机制,两个Glu作为催化残基,从裂缝两侧 伸入作为酶的活性中心,裂缝在反应中作为底物结合区,其两边有多个芳香族氨基酸残基, 并且至少提供四个木糖结合残基。
[0007] 木聚糖酶,广泛分布于细菌、真菌、酵母、放线菌、反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、 陆地植物组织和各种无脊椎动物中,其中细菌来源的中性或碱性木聚糖酶具有较高的耐碱 性和热稳定性。木聚糖酶具有广泛的应用,在造纸工业中,可应用于纸浆漂白、废纸脱墨;在 饲料行业中,木聚糖酶可降低小麦型日粮水溶性木聚糖导致的食糜黏性增高,从而提高消 化酶对底物的作用效率,同时木聚糖酶可作用于不溶性非淀粉多糖,破碎植物细胞壁,并释 放出营养物质;在酿酒和食品行业中应用也非常广泛,如木聚糖酶添加到面粉中,可以改善 面团的持水性、稳定性和对过度发酵的耐受性,提高入炉急涨性能,增大烘烤后面包的体 积,改善面包心质地,降低面包的老化速率,延长货架寿命。
[0008] 由于木聚糖酶在造纸、饲料、食品等工业上的特殊用途,对木聚糖酶进行开发及研 究显得非常重要。国际上已进行了木聚糖酶工业应用的开发,但仅有少量公司能生产用于 造纸工业的木聚糖酶,其耐碱度及耐热性仍有提高空间;国内目前尚无对耐热耐碱性木聚 糖酶的系统性研究,也无法工业化生产耐热耐碱性木聚糖酶。因此,寻找新的具有优良性质 的木聚糖酶对我国造纸工业的可持续发展具有重要意义。

【发明内容】

[0009] 为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种中性内切木聚 糖酶XYN-H31基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本发明根据木聚糖酶保守序列设计简并 引物,用PCR的方法成功克隆出中性内切木聚糖酶的酶基因。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种含有上述XYN-H31基因的表达载体。
[0011]本发明的另一目的在于提供含有上述XYN-H31基因的大肠杆菌菌株。
[0012]本发明的再一目的在于提供上述重组中性内切木聚糖酶XYN-H31的应用。
[0013]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种中性内切木聚糖酶XYN-H31基因,所述 XYN-H31基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0014]所述中性内切木聚糖酶XYN-H31基因序列为一个完整的开放阅读框(0RF),该开放 阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TGA结束,共包括1380个核苷酸。其中,前66个 核苷酸为信号肽编码序列。
[0015] 上述中性内切木聚糖酶XYN-H31基因编码的蛋白质,其氨基酸序列如SEQ ID No:2 所示。
[0016]中性内切木聚糖酶X Y N - Η 3 1基因开放阅读框编码4 5 9个氨基酸,其中, MPNDSLDRRKPPGWRALGRKAL序列(前22个氨基酸)为基因编码的信号肽,其在成熟酶蛋白分泌 时在Leu 22位点被切除。因此,成熟的酶蛋白从Leu23开始,共计437个氨基酸,其理论分子量 (丽〇为46.91^),酶蛋白的理论等电点(?1)为8.18。
[0017 ] -种含有本发明XYN-H31基因的表达载体。
[0018]所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。
[0019 ] 本发明的XYN-H31基因被插入至pET_28a (+)载体中。
[0020] 本发明的XYN-H31基因被插入至pET-28a( + )载体中的EcoR I和Xho頂每切位点之 间;
[0021] 含有本发明的XYN-H31基因的大肠杆菌菌株。
[0022] 所述的大肠杆菌菌株含有本发明的表达载体。
[0023] 一株表达中性内切木聚糖酶XYN-H31的菌株,是将上述核苷酸序列构建成载体后 转染到大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)BL21Star(DE3)得到。
[0024] 一株表达中性内切木聚糖酶XYN-H31的菌株的制备方法,包括如下步骤:
[0025] 用PCR方法从Streptomyces sp.H31(CCTCC No:M 2015003)的基因组0嫩中克隆出 酶基因全长,将其插入到原核表达载体pET-28a( + )中,得到重组质粒pET-28a-XYN-H31,并 转化大肠杆菌E.coli(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)菌株;经过筛选后得到表达所述 的中性内切木聚糖酶XYN-H31的重组大肠杆菌菌株E. co 1 i BL21 Star (DE3) -XYN-H31;
[0026] 所述的PCR的所用的引物的序列:
[0027] 上游引物:5' -CCGGAATTCATGCCCAACGATTCGTTAGACAGGCGCAAG-37 ;
[0028](下划线的序列表示的是EcoR頂每切位点)
[0029] 下游引物:5' -CCGCTCGAGTCAgtgatggtgatggtggtgGGAGACGGAACAGGCTCCGA-37 ;
[0030] (下划线的序列表示的是Xho頂每切位点,小写表示6 X His标签)
[0031]所述的PCR的反应体系为:
[0032] 使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒,以Streptomyces sp.H31 的基因组 DNA为模板,按照如下反应体系配制PCR反应液:
[0033] ddH20 14yL;10XPCR Buffer 2.5yL;dNTP Mixture 2yL;上游引物2yL;下游引物 2此;模板2yL;Ex Taq酶0.5yL;Total 25yL/Sample(样品)。
[0034] 所述的PCR的反应条件为:
[0035] 94°C5min; 94°C30s,55°C30s,72°C1 · 5min,30 个 Cycles; 72°C7min; 25°C 保持。
[0036] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0037] 根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量、等电点及酶学特性等方面 与己知蛋白的差异判断,中性内切木聚糖酶基因 XYN-H31为一新发现的内切β-l,4-木聚糖 酶基因。
【附图说明】
[0038] 图1是pMD-18T克隆载体图谱。
[0039]图2是pMD-18T克隆载体的多克隆位点图。
[0040] 图3是Streptomyces sp ·Η31菌基因组DNA电泳图;其中:泳道Μ为takara公司的 DL15000Marker;泳道 1、2为基因组 DNA。
[0041]图4是中性内切木聚糖酶XYN-H31基因保守序列PCR结果的电泳图;其中:泳道Μ为 takara公司的DL2000Marker;泳道4为ΧΥΝ-Η31基因保守DNA序列。
[0042] 图5是中性内切木聚糖酶XYN-H31基因的保守DNA序列与Genbank基因序列比对结 果,截取了其中相似性最高的序列的结果图。
[0043] 图6是中性内切木聚糖酶XYN-H31基因的保守DNA序列的上游PCR结果的电泳图;其 中:泳道Μ为takara公司的DL2000Marker;泳道4为XYN-H31基因的保守DNA序列的上游PCR结 果。
[0044] 图7是中性内切木聚糖酶XYN-H31基因的保守DNA序列的下游PCR结果的电泳图;其 中:泳道Μ为takara公司的DL2000Marker;泳道2为XYN-H31基因的保守DNA序列的下游PCR结 果。
[0045] 图8是中性内切木聚糖酶XYN-H31与Genbank氨基酸序列比对结果,截取了其中相 似性最高的序列的结果图。
[0046] 图9是pET_28a( + )表达载体图谱。
[0047]图10是pET_28a( + )表达载体的多克隆位点图。
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