低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡 糖胺酶。
【背景技术】
[0002] 几丁质是由Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖单体通过β_1，4键形成的多聚糖，广泛存在于真 菌、昆虫细胞壁以及甲壳类动物外骨骼中，其蕴藏量仅次于纤维素，居天然生物多聚高分子 的第二位，但大量的几丁质并未得到有效利用，每年超过80000吨的几丁质被废弃(Patil et al.，Enzyme and Microbial Technology,2〇〇〇,26:473_483)。0-1^-乙酰葡糖胺酶属于 几丁质降解酶系中的一种水解酶，可催化几丁寡糖降解为N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体，在几 丁质的彻底水解中起到关键性作用。根据氨基酸序列同源性，β-Ν-乙酰葡糖胺酶主要归类 于糖苷水解酶第3、20、73和84家族（Cantarel et al.，Nucleic acids research,2009,37: D233-D238)』-N-乙酰葡糖胺酶被广泛应用于功能性食品、保健品、化妆品、制药、饲料添加 剂、生物燃料及生物防治等领域（Yang et al·，Journal of Agricultural and Food Chemistry ,2014,62 :5181-5190)。因为大多数β-Ν-乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即N-乙 酰-D-胺基葡萄糖的抑制，所以耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可更有效地使几丁质彻底 水解;另外，β-N-乙酰葡糖胺酶可解除几丁寡糖对内切几丁质酶的抑制作用，从而与内切几 丁质酶产生协同作用（Yang et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014,62: 5181-5190)。耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和海 产品加工及其它高盐环境生物技术领域，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染 并节省灭菌等所消耗的能源(Madern et al .Extremophiles,2000,4:91-98)。低温酶在低 温环境中具有较高的酶活，相对于中温或高温酶有其特有的应用优势，如水产生境常常为 10-25°C;将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用 (Cavicchioli et al .Microbial Biotechnology ,2011,4:449-460)。低温耐盐的β-N-乙酰 葡糖胺酶在降解海洋生物来源的几丁质方面具有独特的优势。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，旨在解决 大量的几丁质并未得到有效利用的问题。
[0004] 本发明是这样实现的，一种低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，所述低温 耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 进一步，所述低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶本总共含666个氨基酸，理 论分子量为70.94kDa。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种所述低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶 的制备方法，所述低温耐盐耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制备方法包括以下步骤：
[0007] 包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 jblOnagA的重组载体，重组载体为pEasy-E2- jblOnagA，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接， 用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0008]培养重组菌株，诱导重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA表达；
[0009]回收所表达的β-N-乙酰葡糖胺酶JBlONagA。
[0010] 进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌 细胞BL21，得到重组菌株BL21 / jb 1 OnagA。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种所述低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶 的重组载体。
[0012] 进一步，所述重组载体是将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列 与表达调控序列相连接。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种所述低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶 的重组菌株，重组菌株为BL21/jbl0nagA。
[0014] 本发明提供的低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶是一种新活性的β-Ν-乙 酰葡糖胺酶:该酶的最适pH值为6，在ρΗ5.0-7.0的范围内维持30 %以上的酶活性;经ρΗ6.0-8.0的0.1Μ Mcl 1 vaine buffer处理lh，该酶酶活剩余85%以上；该酶最适温度为50°C，在0 °(3、10°(3和20°(3分别具有2.0%、8.5%和22.5%活性 ;在30°(3以下处理111，该酶活力基本无 影响；在20 % (w/v)的NaCl中，该酶仍然具有55 %的活性;在反应体系中加入终浓度为20mM 的N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约82 %的活性;该酶可催化水解几丁寡糖并与内切 几丁质酶协同降解几丁质。本发明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可应用于海产品加工、生物燃料、医 学、功能性食品等行业。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明实施例提供的低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶制备方法流 程图。
[0016] 图2是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA 的SDS-PAGE分析；
[0017]图中:Μ:蛋白质Marker; CK:含载体pEasy-E2大肠杆菌菌体破碎上清液;S1:含有重 组载体pEasy-E2-jblOnagA的大肠杆菌菌体破碎上清液;S2:纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶 JBlONagA。
[0018]图3是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的pH活性。 [0019]图4是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的pH稳定性。 [0020]图5是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的热活性。 [0021]图6是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的热稳定性。 [0022]图7是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JB 1 ONagA在不同浓度 NaCl中的活性。
[0023]图8是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JB1 ONagA水解二乙酰壳 二糖及四乙酰壳四糖的产物分析；
[0024]图中:M:N-乙酰-D-胺基葡萄糖;CK1:二乙酰壳二糖与灭活的JB10NagA;Sl:二乙酰 壳二糖与有活性的JB10NagA;CK2:四乙酰壳四糖与灭活的JB10NagA;S2:四乙酰壳四糖与有 活性的JBlONagA。
[0025] 图9是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA在不同浓度N-乙酰-D-胺基葡萄糖中的活性。
【具体实施方式】
[0026] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0027] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0028]如图1所示，本发明实施例的低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶制备方法 包括以下步骤：
[0029] S101:包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 jblOnagA的重组载体，优选为pEasy-E2- jblOnagA，将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中，使核苷酸序列与表达调控序列相连接， 用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0030] S102:培养重组菌株，诱导重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA表达；
[0031] S103:回收所表达的β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA。
[0032]本发明的低温耐盐耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可得自申氏杆菌（Shinella sp.);JB10NagA的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0033]申氏杆菌(Shinella sp.)，遗传资源取自微生物，获取方式为自行采集;于2010年 1 〇月由周峻沛在中国、云南省、红河哈尼族彝族自治州采集。
[0034]本发明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA总共含666个氨基酸，理论分子量为 70 · 94kDa。该酶的最适pH值为6，在pH5 · 0-7 · 0的范围内维持30 %以上的酶活性;经pH6 · 0-8.0的0.1M Mcl 1 vaine buffer处理lh，该酶酶活剩余85%以上；该酶最适温度为50°C，在0 °(3、10°(3和20°(3分别具有2.0%、8.5%和22.5%活性 ;在30°(3以下处理111，该酶活力基本无 影响；在20 % (w/v)的NaCl中，该酶仍然具有55 %的活性;在反应体系中加入终浓度为20mM 的N-乙酰-D-胺基葡萄糖时，该酶仍保留约82 %的活性;该酶可催化水解几丁寡糖并与内切 几丁质酶协同降解几丁质。
[0035] 本发明提供了编码上述β-Ν-乙酰葡糖胺酶的基因 jblOnagA，该基因序列如SEQ ID NO.