耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag及其制备方法

文档序号:9722640阅读:663来源:国知局
耐产物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶HJ5nag及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域,尤其涉及一种耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 几丁质是由Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖单体通过β_1,4键组成的多糖,广泛存在于真 菌、昆虫细胞壁以及甲壳类动物外骨骼中,其含量仅次于纤维素,因此几丁质的水解具有重 要的意义。内切几丁质酶可以把几丁质降解为几丁寡糖,而β-N-乙酰葡糖胺酶可催化几丁 寡糖降解为Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖,因而β-Ν-乙酰葡糖胺酶对几丁质的完全水解起到关键 性的作用;同时,由于内切几丁质酶会被几丁寡糖抑制,所以β-Ν-乙酰葡糖胺酶可解除几丁 寡糖对内切几丁质酶的抑制作用,从而与内切几丁质酶产生协同作用(Yang et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181-5190)。但是,大多数β_Ν_ 乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即N-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制,需要耐产物抑制的β-Ν-乙 酰葡糖胺酶才能使几丁质更有效地彻底水解(Yang et al·,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181-5190)。根据氨基酸序列同源性,β-Ν-乙酰葡糖胺酶主 要归类于糖苷水解酶第3、20、73和84家族(Cantarel et al.,Nucleic acids research, 2009,37 :D233-D238) J-N-乙酰葡糖胺酶被广泛应用于功能性食品、保健品、化妆品、制药、 饲料添加剂和生物杀虫剂等领域(Yang et al·,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:5181-5190)。例如,β-Ν-乙酰葡糖胺酶水解几丁寡糖的产物N-乙酰-D-胺基葡萄糖单体具有抗炎作用,对于溃疡结肠炎和其他的胃肠炎症的治疗有很好的效果 (Salvatore et al.,Alimentary pharmacology&therapeutics,2000,14:1567-1579),N-乙酰-D-胺基葡萄糖也应用于治疗儿童慢性肠炎疾病以及骨关节炎(Shikhman et al., Annals of the rheumatic diseases,2005,64:89-94)〇

【发明内容】

[0003] 本发明的目的在于提供一种耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及其制备方法,旨在 解决现有的β-N-乙酰葡糖胺酶易受到水解产物即Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制从而导致几 丁质水解效率较低的问题。
[0004] 本发明是这样实现的,一种耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶,所述耐产物抑制的 β-Ν-乙酰葡糖胺酶的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.1所示。
[0005] 进一步,所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶总共含535个氨基酸,理论分子量为 55.89kDa,其中Ν端有25个氨基酸为预测信号肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA,成熟的 34-乙酰葡糖胺酶耵5仙8含510个氨基酸。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制备方 法,所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制备方法包括以下步骤:
[0007] 首先用包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 hJ5nag的重组载体,重组载体为pEasy-E2- hJ5nag,将乙酰葡糖胺酶基因插入到表达载体中,使核苷酸序列与表达调控序列相连接,重 组载体转化宿主细胞,得重组菌株;
[0008]然后培养重组菌株,诱导重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag表达;
[0009]最后回收所表达的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag。
[0010] 进一步,所述宿主细胞为大肠杆菌细胞,将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌 细胞BL21 (DE3),得到重组菌株BL21 (DE3) /hJ5nag。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种包含所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重 组载体。
[0012] 进一步,所述重组载体是将β-Ν-乙酰葡糖胺酶的基因插入到表达载体中,使核苷 酸序列与表达调控序列相连接。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种包含所述耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的重 组菌株。
[0014]进一步,所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
[0015] 本发明提供的耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶及其制备方法,采用新活性的β-Ν-乙酰葡糖胺酶:最适ΡΗ6;最适温度为45°C ;可催化水解几丁寡糖;在反应体系加入终浓度 20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖时,该酶仍保留约69.5 %活性;该酶可与内切几丁质酶协同降 解几丁质。本发明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可应用于海产品加工、医学、功能性食品等行业。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明实施例提供的耐产物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶的制备方法流程图。 [0017]图2是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的 SDS-PAGE 分析;
[0018]图中:Μ:蛋白质Marker; CK:含载体pEasy-E2大肠杆菌菌体破碎上清液;S1:含有重 组载体pEasy-E2-hJ5nag的大肠杆菌菌体破碎上清液;S2:纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶 HJ5nag〇
[0019 ]图3是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的pH活性。
[0020]图4是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的pH稳定性。 [0021]图5是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的热活性。
[0022]图6是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的热稳定性。 [0023]图7是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag水解二乙酰壳二 糖及四乙酰壳四糖的产物分析;
[0024]图中:M:N-乙酰-D-胺基葡萄糖;CK1:二乙酰壳二糖与灭活的HJ5nag;Sl:二乙酰壳 二糖与有活性的HJ5nag,CK2:四乙酰壳四糖与灭活的HJ5nag;S2:四乙酰壳四糖与有活性的 HJ5nag〇
[0025] 图8是本发明实施例提供的纯化的重组β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag在不同浓度N-乙 酰-D-胺基葡萄糖中的活性。
【具体实施方式】
[0026] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明 进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于 限定本发明。
[0027] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0028] 本发明所述β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag可得自微杆菌(Microbacterium sp ·)。 HJ5nag的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0029] 微杆菌(Microbacterium sp.),遗传资源属于微生物,获取方式为自行采集;于 2010年10月,由周峻沛在中国、云南省、楚雄彝族自治州采集。
[0030] 本发明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag总共含535个氨基酸,理论分子量为55.89kDa, 其中N端有25个氨基酸为预测信号肽序列MNRRRGRAIAAATVLAASLAGCSPA,成熟的β-Ν-乙酰葡 糖胺酶HJ5nag含510个氨基酸。该酶最适ρΗ6;最适温度为45°C;可催化水解几丁寡糖;在反 应体系加入终浓度20mM N-乙酰-D-胺基葡萄糖时,该酶仍保留约69.5 %活性;该酶可与内 切几丁质酶协同降解几丁质。
[0031] 本发明提供了编码上述β-Ν-乙酰葡糖胺酶的基因 hJ5nag,该基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0032] 本发明通过基因组测序的方法获得β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag的编码基因 hJ5nag, 其全长1608bp,起始密码为ATG,终止密码为TGA。
[0033] 经BLAST比对,该β-Ν-乙酰葡糖胺酶HJ5nag为糖苷水解酶第20家族序列,其全序列 与GenBank中的Microbacterium sp.Rootl80来源的β-N-乙酰葡糖胺酶序列(WP_ 056119055)具有最高的氨基酸序列一致性,为76.3%。该Microbacterium sp.Rootl80来源 的蛋白只是通过序列相似性判断为β-Ν-乙酰葡糖胺酶,其活性还未研究,无法得知该蛋白 的pH活性范围、热活性范围及Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖的抑制程度等酶学性质。
[
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1