一种高效、可循环生物催化剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效、可循环生物催化剂的制备方法，属于生物催化剂的制备技术。
【背景技术】
[0002]生物催化由于具有温和、高效和高选择性等特点，在大宗化学品和精细化学品的工艺取代等方面发挥日益重要的作用。尽管生物催化剂(酶、细胞)具有上述优势，但是难以循环且容易失活，限制了生物催化的广泛应用。杂化微囊由于具有独特的核壳结构、杂化囊壁、高的比表面积和较短的传质距离，已广泛用于生物催化剂的构建。其中空心内核可用于包埋酶分子，杂化囊壁可以实现物质的交换。通过调控囊壁中有机、无机组分，可得到适宜的微环境和良好的机械性能。因此，利用杂化微囊构建的生物催化剂表现出了良好的活性和稳定性。然而，杂化微囊的循环需要借助离心或过滤等操作，限制了杂化微囊的大规模应用。此外，循环或过滤过程易造成微囊的破损，影响了其循环稳定性。开发一种高效、可循环生物催化剂的制备方法具有重要价值和迫切需求。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种高效、可循环生物催化剂的制备方法。本发明制备原料廉价、易得，制备工艺简单易行。
[0004]本发明提出的一种高效、可循环生物催化剂的制备方法，包括以下步骤:
[0005]步骤一、向浓度为0.2?0.4M的碳酸钠溶液中加入聚苯乙烯磺酸钠，配成聚苯乙烯磺酸钠浓度为1?3mg/mL的溶液A;配制和碳酸钠溶液等摩尔浓度的氯化钙溶液，向氯化钙溶液中加入葡萄糖氧化酶，配成葡萄糖氧化酶浓度为0.5?lmg/mL的溶液B;在800?1200r/min转速下，将溶液A迅速倒入等体积的溶液B中，反应25?30s，静置8?lOmin，在3000r/min的转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤，重复离心-水洗，至上清液不含聚苯乙烯磺酸钠和葡萄糖氧化酶，得到包埋了葡萄糖氧化酶的碳酸钙微球；
[0006]步骤二、向水中加入一定质量的琼脂糖，加热溶解后，配成琼脂糖浓度为1%?3 %w/v的溶液C;将步骤一制得的葡萄糖氧化酶的碳酸钙微球加入溶液C中，混合均匀，自然冷却，得到分散有葡萄糖氧化酶的碳酸钙微球的琼脂糖凝胶；
[0007]步骤三、配制浓度为l-3mg/mL的精蛋白溶液;配制浓度为0.01?0.03M的硅酸钠溶液，调节硅酸钠溶液的pH为7.0?8.0;
[0008]步骤四、先将步骤二制得的琼脂糖凝胶浸泡到精蛋白溶液中5-15min，随后取出再浸泡到去离子水中清洗;然后，将清洗后的琼脂糖凝胶浸泡到硅酸钠溶液中5-15min，随后取出再浸泡到水中清洗;执行步骤四1?2次；
[0009]步骤五、配制乙二胺四乙酸二钠浓度为0.03?0.05M的溶液D，调节溶液D的pH为5.0?6.0;将步骤四得到的琼脂糖凝胶浸泡到溶液D中，每15min换一次溶液D，至完全去除碳酸钙微球为止;随后将琼脂糖凝胶浸泡到去离子水中清洗，至上清液不含乙二胺四乙酸二钠，所得胶体即为高效、可循环生物催化剂。
[0010]与现有技术相比，本发明所具有的有益效果是:
[0011]本发明制备方法首先是利用共沉淀法制备了包埋有葡萄糖氧化酶的碳酸钙微球，随后利用溶胶-凝胶法将碳酸钙微球分散到琼脂糖凝胶中。在碳酸钙微球表面实施仿生矿化，形成了精蛋白-氧化硅杂化囊壁。随后将上述凝胶浸泡到乙二胺四乙酸二钠溶液中去除碳酸钙微球，得到分散有精蛋白-氧化硅杂化微囊的琼脂糖凝胶，并将葡萄糖氧化酶包埋到了杂化微囊囊腔中。上述胶体用作催化剂时表现出了良好的活性和循环稳定性，可用镊子实现简单回收。本发明制备原料廉价、易得，制备条件温和，制备工艺简单易行，通过控制制备过程中仿生矿化步骤的次数，可实现生物催化剂性能的调控。
【附图说明】
[0012]图1为实施例1制备的胶体用作催化剂时溶液吸光度随时间的变化曲线；
[0013]图2为实施例1制备的胶体用作催化剂时的循环稳定性；
[0014]图3为实施例2制备的胶体用作催化剂时溶液吸光度随时间的变化曲线；
[0015]图4为实施例2制备的胶体用作催化剂时的循环稳定性；
[0016]图5为对比例1制备的微囊用作催化剂时溶液吸光度随时间的变化曲线；
[0017]图6为对比例1制备的微囊用作催化剂时的循环稳定性；
[0018]图7为对比例2制备的微囊用作催化剂时溶液吸光度随时间的变化曲线；
[0019]图8为对比例2制备的微囊用作催化剂时的循环稳定性。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细描述，所描述的具体实施例仅对本发明进行解释说明，并不用以限制本发明。
[0021]实施例1
[0022]步骤一、向浓度为0.3M的碳酸钠溶液中加入聚苯乙烯磺酸钠(PSS)，配成PSS浓度为3mg/mL的溶液A ；配制和碳酸钠溶液等摩尔浓度的氯化钙溶液，向氯化钙溶液中加入葡萄糖氧化酶(G0D)，配成G0D浓度为lmg/mL的溶液B;在800r/min转速下，将溶液A迅速倒入等体积的溶液B中，反应30s，静置lOmin，在3000r/min的转速下离心分离，去除上清液后用去离子水洗涤，重复离心-水洗，至上清液不含PSS和G0D，得到包埋了 G0D的碳酸钙微球(G0D-encapsulated CaC03微球)；
[0023]步骤二、向水中加入一定质量的琼脂糖，加热溶解后，配成琼脂糖浓度为l%w/v的溶液C;将GOD-encapsulated CaC03微球加入溶液C中，混合均匀，自然冷却，得到分散有GOD-encapsulated CaC03微球的琼脂糖凝胶D;
[0024]步骤三、配制浓度为3mg/mL的精蛋白溶液;配制浓度为0.03M的硅酸钠溶液，调节溶液的pH为7.0;
[0025]步骤四、将凝胶D浸泡到精蛋白溶液中15min，随后将凝胶D浸泡到去离子水中清洗;将凝胶D浸泡到硅酸钠溶液中15min，随后将凝胶D浸泡到水中清洗；
[0026]步骤五、配制乙二胺四乙酸二钠(EDTA)浓度为0.05M的溶液E，调节溶液E的pH为6.0;将步骤四得到的凝胶D浸泡到溶液E中，每15min换一次溶液E，至完全去除碳酸钙微球为止;随后将凝胶浸泡到去离子水中清洗，至上清液不含m)TA;
[0027]步骤六、配制浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液，调节溶液的pH为7.0 ;配制浓度为0.005M的葡萄溶液;配制浓度为0.1M的醋酸盐缓冲液，调节溶液的pH为5.0 ;配制浓度为0.004M的3，3"，5，5"-四甲基联苯胺(TMB)溶液;配制浓度为lmg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)的溶液;取0.5mL的葡萄溶液加入4.5mL的磷酸盐缓冲液中，配制溶液F;取0.10mL的TMB溶液和0.05mL的HRP溶液加入0.83mL的磷酸盐缓冲液中，配制溶液G;
[0028]步骤七、将步骤五制备的胶块加入到溶液F中；每隔30min，