花生逆境胁迫AhbHLH1L基因克隆及功能表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种花生逆境胁迫AhbHLHIL基因克隆及功能表达 方法。
【背景技术】
[0002] 花生富含油脂和蛋白，是我国重要的油料作物和经济作物。花生的产量和品质受 干旱、盐碱等胁迫影响非常严重，全国每年因干旱引起的花生减产率达20%以上。但由于花 生品种资源遗传基础狭窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐盐的基因源，利用常规育种方法难以培 育出高抗品种。随着分子生物学的快速发展，近年来利用转基因技术提高植物胁迫耐受能 力的研究取得了显著成果，对胁迫相关基因和信号转导途径也有了更深入的了解。
[0003] bHLH类转录因子是一类较大的转录因子家族。近年来，一些bHLH类转录因子在植 物逆境胁迫调控中可能发挥着重要功能。拟南芥的ICE1和ICE2均编码bHLH类转录因子，二 者均作用于CBF/DREB转录因子的上游，在低温胁迫下可以促进该类基因的表达，从而在拟 南芥对低温的适应性中起到了关键作用。拟南芥中bHLH192基因的表达对干旱、高盐及低温 胁迫都有响应，在拟南芥中超表达该基因能够提高转基因植株对盐胁迫的抗性。近年也发 现水稻中多个bHLH类转录因子在转基因拟南芥或水稻中对转基因植株对低温、盐或干旱胁 迫的抵抗能力方面具有积极的调控作用。目前花生中还没有bHLH类转录因子克隆及功能研 究的报导，本研究通过芯片杂交发现该基因在花生盐处理芯片中表达上调明显，随后对该 基因进行了基因克隆及功能研究。
【发明内容】
[0004] 为了提高花生生长的抗逆能力，增强其对高盐、干旱和低温胁迫的抗性，发明了一 种花生逆境胁迫相关基因 AhbHLHIL的克隆及功能表达方法。
[0005] -种花生逆境胁迫AhbHLHIL基因克隆及功能表达方法，主要包括以下步骤： (1)材料的准备与处理 材料为花生花育33(Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)。花生种子在营养土和 蛭石以2:1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗（28°C/22°C)。生长约2 周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理； 低温处理，将三叶期花生幼苗置于4°C光照培养箱中进行处理，分别于处理的0h，lh， 3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为材料;对于耐盐用NaCl处理;对于抗旱，用 PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡 在200mM NaCl或重量浓度20 %PEG6000溶液中，在处理时间为Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和 72h分别取花生的叶片和根作为材料。所有材料均保存于-80°C超低温冰箱中备用。
[0006] (2)RNA的提取和cDNA的合成 本实验用天根的RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离提取花生幼苗RNAeRQIRNase-free DNasel将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用Takara的M-MLV反转录试剂盒进 行cDNA的合成，25-yL反应体系中包含2yg RNA。在42°C条件下经过60min的反转录反应后将 反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20°C低温冰箱中保存备用。
[0007] (3)基因克隆 通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA Taq? DNA polymerase(TaKaRa)， 在25-yL体系中加入以下成分：2.5yL 10XPCR buffer(含MgCl2);2.5yL 10mM dNTPs;lyL cDNA模板；0.5yL LA polymerase和 17.5yL ddifeOc^PCR反应条件为：（a)94°C，5min;(b)94 °<3,458;54°(3,608;72°(3,908 ;共35〇7(3168;((3)72°(3，101^11。扩增基因全长所用引物为 AhbHLHIL-S:5 '-ACTGAATGCTCCTGTGCCC-3 ' 和AhbHLHIL-A:5 '-GCTCCTGCCCTTTGCTATCT-3 '。 PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒(Omega)进行纯化，纯化产物连接 pMD18_T Easy vector(Takara)并测序（Sangon,Shanghai)。
[0008] 本发明的AhbHLHIL基因开放阅读框为1260bp，共编码420个氨基酸。
[0009] 本发明的AhbHLHIL基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因 氨基酸序列上有DNA结合位点，蛋白二聚体互作区及HLH保守结构域，同时该基因编码的氨 基酸序列与大豆bHLH130-like同源性近60%。
[0010]本发明的AhbHLHIL基因的核苷酸序列是序列表中序列1。
[0011] 本发明的AhbHLHIL基因的氨基酸序列是序列表中序列2。
[0012] ⑷表达分析 用荧光定量Real-time RT-PCR对AhbHLHIL基因进行表达分析。荧光定量PCR所用cDNA 模板稀释到8ngyL-S用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taq polymerase(Takara)，用的仪器是 LightCycler 2 · Oinstrument system(Roche，Germany)，每反应体系加2yL稀释的cDNAqPCR 反应程序如下：（1)95°<3，108;(2)95°(3,58,4(^7(3168;(3)60°(3,308 ;(4)72°(3，108。？〇?反应 结束后绘制溶解曲线，温度增加梯度为每10秒增加 O.Stdctinll为实验的内参基因。
[0013] AhbHLHIL荧光定量验证用的引物序列为：QAhbHLHIL-S: 5'-GAGTGTTATGTATA GTCCTGTTC-3 ' 和QAhbHLHIL-A:5 '-TGTTGTTGTTGATGATGATGA-3 '。
[0014] 内参基因&(：衍1111所用引物序列为：〇厶(：1'11-5 :5'-1766厶厶了6661^6厶厶66厶了6(：-3'和 QACT11-A:5 '-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3 '。
[0015]本发明的显著效果 通过荧光定量PCR验证了 AhbHLHIL在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明 该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高（图1)。从图1可以看出，AhbHLHIL 在低温、盐和干旱处理的根中表达量均有明显提高，并且此后一直维持在高于对照的水平 (图1A，C，E)，在盐处理的叶片中表达量也明显增高（图1D)。以上结果表明AhbHLHIL可能在 花生对逆境胁迫的适应性中发挥重要作用。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基 因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。说明AhbHLHIL基因能显著提高植物的抗 逆性。
【附图说明】
[0016] 图1 AhbHLHIL基因在花生根(A，C，E)和叶片(B，D，F)中受NaCl(A，B)、低温(C，D)和 PEG6000 (E，F)胁迫处理不同时间表达变化分析。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图与具体实施例进一步说明本发明，但并不是对本发明的进一步限 定。
[0018] 本发明的具体实施过程为： 1实验材料与方法 1.1实验材料 实验材料为花生花育33(Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)。花生种子在营养 土和蛭石以2:1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗（28°C/22°C)。生 长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理实验。
[0019] 对于低温处理，将三叶期花生幼苗至于4°C光照培养箱中进行处理，分别于处理的 Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生叶片和根作为实验材料;对于耐盐用NaCL处理;对 于抗旱，用PEG6000处理。将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生 根分别浸泡在200mM NaCl或20 %PEG6000溶液中，在处理的Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和 72h分别取花生的叶片和根作为实验材料。所有材料均保存于-80°C超低温冰箱中备用。
[0020] 1.2 RNA的提取和cDNA的合成 本实验用天根的RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离提取花生幼苗RNAeRQIRNase-free DNasel将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成。用M-MLV Reverse Transcriptase (Promega，Madison，WI，USA)进行cDNA的合成，25-yL反应体系中包含2yg RNA。在42°C条件 下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于-20°C 低温冰箱中保存备用。
[0021] 1.3基因克隆 通过RT-PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA