一种提高聚合酶链式反应特异性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物技术领域。更具体地，涉及一种提高聚合酶链式反应特异性 的方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(PCR)是一种在生物技术领域广为使用的有效扩增脱氧核糖核酸 (DNA)片段的方法。常规PCR基本原理为：依据已知的待扩增目的DNA序列设计一对与目的 DNA序列两条单链完全互补的相向的特异性引物，然后将模板DNA、引物、DNA聚合酶、4种脱 氧核苷酸(dNTPs)放入反应缓冲液中，然后通过高温变性、低温复性、中温延伸的过程使目 的DNA片段得到扩增。在高温变性阶段，模板双链DNA变性变为单链;在低温复性阶段，序列 互补的单链将重新结合为双链，此时分别与模板DNA两条单链完全互补的引物片段因在体 系内的浓度优势将优先与对应的模板DNA单链重新结合为局部双链，两条引物在模板DNA上 的结合位置决定了扩增片段的长度。在中温延伸阶段，DNA聚合酶结合于引物的3'端并依据 模板DNA序列利用dNTPs特异的合成新的互补链。这三个步骤每重复一次，目的DNA片段理论 上会扩增1倍，通过对这三个步骤的重复进行，就可大量而特异性的扩增目的DNA片段。
[0003] PCR的基本组分包括模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs和含有镁离子的缓冲液，其 中引物是决定PCR反应特异性的关键因素，只有当引物与目的扩增片段完全匹配时才能特 异性扩增目的片段。目前普遍认为常规PCR适宜采用的引物长度约为15bp~25bp，且整个引 物序列应与目的扩增片段完全互补，但在实践过程中发现仅当引物的3 '扩增起始端部分序 列与模板DNA互补时也可以成功进行PCR扩增。如引物3'端在模板DNA上结合的位置正确且 与模板完全互补的部分序列足够长，则也可以成功而特异的扩增目的片段，因此引物足够 长时其5'端局部序列与模板DNA不完全匹配可不影响PCR的成功进行。但当拟扩增的目的 DNA序列本身特异性不高且在模板DNA中存在较多的相似序列时，引物的3 '端就可能在模板 DNA上存在多个结合位点，在此情况下PCR就出现了非特异性扩增，当非特异性扩增现象严 重时甚至会导致目的片段不能扩增，此时PCR反应失败。
[0004] 目前，普遍应用的提高PCR反应特异性的方法主要包括：（1)设计多条引物以筛选 高特异性引物，但当目的序列特异性较差时此方案效果欠佳；（2)提高PCR反应的退火温度： 当引物在模板上存在多个非特异性结合位点时，与特异性结合位点相比，大部分非特异性 结合位点仅为引物与模板的部分互补结合，其结合力弱、稳定性差，因此当退火温度升高 时，引物的非特异性结合位点减少，PCR反应特异性增高;但是此种方法也存在局限性，当目 标序列或引物特异性较差时，模板上多个引物结合位点的结合稳定性差异往往不大，提高 退火温度也不能有效提高PCR反应特异性；（3)应用高保真的Taq酶:此方法是在引物特异性 尚可的情况下进一步提高PCR反应特异性的方法，因此有很多非特异性扩增用该办法也无 法解决。
[0005] 综上所述，寻找更好更多的提高PCR反应特异性的方法，对于PCR检测的应用十分 必要。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有提高PCR反应特异性的方法的缺陷和不足， 提供一种提高聚合酶链式反应(PCR)特异性的方法，即在常规PCR所使用的特异性引物的5' 端添加一段与模板非同源且不形成稳定二级结构的序列，其长度可为几个至几十个碱基 (一般采用9~20个碱基）。另外进一步地，还可采用复合PCR反应条件进一步提高PCR反应特 异性(复合反应条件:第一个循环阶段采取5~10循环的常规PCR反应条件，第二个循环阶段 采用高温的退火和延伸步骤合并的两步法PCR条件）。
[0007] 本发明的目的是提供一种提高聚合酶链式反应特异性的方法。
[0008] 本发明另一目的是提供一种提高EGFR基因18、19、20、21外显子的？〇?反应特异性 的方法。
[0009] 本发明再一目的是提供EGFR基因18、19、20、21外显子的高特异性扩增引物。
[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0011] -种提高聚合酶链式反应特异性的方法，是在所述聚合酶链式反应的引物对的5' 端加尾;所述加尾是指在引物对的5'端添加一段与模板非同源且不形成稳定二级结构的序 列。
[0012] 引物5'端所加的尾其长度可为几个到几十个碱基，优选为9~20个碱基。具体加尾 的长度取决于拟采用的目标退火温度。
[0013] 同时尾序列可为非固定序列，只要其不与待扩增的样品高度同源且不会形成引物 内或间稳定的二级结构影响PCR扩增即可。
[0014] 另外，所述加尾是指在引物对中的两条引物的5'端均加尾，两条引物加尾的碱基 数相同，所述加尾为9~20个碱基。
[0015] 上述5 '端加尾后引物的工作浓度与常规引物一致甚至更低。
[0016] 根据上述要求所设计出的5'加尾引物使用常规三步法PCR反应条件时即可在提高 反应特异性的情况下有效扩增，显著提高PCR反应的特异性。
[0017] 具体地，作为一种可实施的优选方案，上述加尾是指在上游引物的5'端添加10bp 上游加尾序列、15bp上游加尾序列或20bp上游加尾序列，对应地在下游引物的5'端添加 l〇bp下游加尾序列、15bp下游加尾序列或20bp下游加尾序列；
[0018] 所述 l〇bp 上游加尾序列为 CTCGGGATTA、GTCGGCATTA、AGCGGAATTA 或 AGCGGGATTA;
[0019] 所述 15bp 上游加尾序列为 TGTTACTCGGGATTA、GGTCAGTCGGCATTA、AGTCAAGCGGAATTA 或GCTCAAGCGGGATTA;
[0020] 所述 20bp 上游加尾序列为 CGCTATGTTACTCGGGATTA、CCCCAGGTCAGTCGGCATTA、 CCCCAAGTCAAGCGGAATTA或CACGAGCTCAAGCGGGATTA;
[0021] 所述 l〇bp 下游加尾序列为 CTGAGAGCAC、CGGTCAGCAC、CTCTCAGCAC 或 CTCAAATCAC;
[0022] 所述 15bp 下游加尾序列为 CACGACTGAGAGCAC、CACGACGGTCAGCAC、CACCACTCTCAGCAC 或CACGACTCAAATCAC;
[0023] 所述 20bp 下游加尾序列为 AGCGGCACGACTGAGAGCAC、TTCGGCACGACGGTCAGCAC、 TTCTGCACCACTCTCAGCAC或TTCTGCACGACTCAAATCAC。
[0024] 更进一步地，作为一种可实施的优选方案，优选地，所述加尾是指在上游引物的5' 端添加 lObp上游加尾序列CTCGGGATTA，在下游引物的5'端添加 lObp下游加尾序列 CTGAGAGCAC；
[0025] 或在上游引物的5'端添加 lObp上游加尾序列GTCGGCATTA，在下游引物的5'端添 加 lObp下游加尾序列CGGTCAGCAC;
[0026] 或在上游引物的5 '端添加 lObp上游加尾序列AGCGGAATTA，在下游引物的5 '端添加 lObp下游加尾序列CTCTCAGCAC;
[0027] 或在上游引物的5 '端添加 lObp上游加尾序列AGCGGGATTA，在下游引物的5 '端添加 1 〇bp下游加尾序列CTCAAATCAC;
[0028]或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列TGTTACTCGGGATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACGACTGAGAGCAC;
[0029] 或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列GGTCAGTCGGCATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACGACGGTCAGCAC;
[0030] 或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列AGTCAAGCGGAATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACCACTCTCAGCAC;
[0031] 或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列GCTCAAGCGGGATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACGACTCAAATCAC;
[0032] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CGCTATGTTACTCGGGATTA，在下游引物 的5 '端添加20bp下游加尾序列AGCGGCACGACTGAGAGCAC;
[0033] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CCCCAGGTCAGTCGGCATTA，在下游引物 的5 '端添加20bp下游加尾序列TTCGGCACGACGGTCAGCAC;
[0034] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CCCCAAGTCAAGCGGAATTA，在下游引物 的5'端添加20bp下游加尾序列TTCTGCACCACTCTCAGCAC;
[0035] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CACGAGCTCAAGCGGGATTA，在下游引物 的5'端添加20bp下游加尾序列TTCTGCACGACTCAAATCAC。
[0036] 作为另一种可实施的优选方案，优选地，所述加尾是指在上游引物的5'端添加9bp 上游加尾序列CCACTCCGA，在下游引物的5 '端添加9bp下游加尾序列ACCTGTCGA;
[0037] 或在上游引物的5'端添加13bp上游加尾序列CCGCCCACTCCGA，在下游引物的5'端 添加13bp下游加尾序列CTTGACCTGTCGA;
[0038] 或在上游引物的5'端添加17bp上游加尾序列CCGCCCGCCCACTCCGA，在下游引物的 5'端添加17bp下游加尾序列ACCGCTTGACCTGTCGA。
[0039] 另外，将本发明上述的5'加尾引物与复合PCR反应条件结合使用，可进一步提高 PCR反应的特异性。与普通PCR引物相比，本发明所述的加尾引物可有效提高PCR反应的特 异性但不影响灵敏度，同时引物工作浓度与常规引物一致甚至更低，在使用常规PCR反应条 件时即可显著提高PCR特异性。如果部分反应特异性仍不理想，则可使用加尾引物结合复合 PCR反应条件的组合模式来进一步提高反应特异性。
[0040] 所述复合PCR反应条件必须由一个常规PCR反应条件加高温的退火和延伸步骤合 并的两步法PCR条件；第一个循环阶段采取5~10循环的常规PCR反应条件（必须具备该步 骤，否则会导致两步法扩增失败或扩增效率低下），第二个循环阶段采用高温的退火和延伸 步骤合并的两步法PCR条件;所述退火和延伸的温度相同，均为64~79°C。退火合并延伸阶 段的反应温度明显较常规PCR反应条件中的退火温度高而与延伸温度接近，具体适宜反应 温度的选择需通过筛选实验确定。
[0041 ]另外，作为本发明方法的举例验证，本发明以EGF